芋头(Colocasia esculenta (L.) Schott)又称为芋艿,是世界第5 大块茎类作物,富含淀粉等多种营养成分,品质独特,特别是以芋头作为原料制作而成的芋泥,食用便捷,深受广大消费者青睐,尤其是红芽芋泥质地绵软、口感细腻,而荔浦芋泥具有醇厚的香味,两者复配制作的芋泥,具有广阔的市场前景。由于芋泥含有大量膳食纤维,会阻止面筋水合,也导致了目前芋泥几乎不会作为原料加入到面制品中,而多用于面包馅料[1]。因此,拓宽芋泥资源的应用方式,实现其从馅料到原料主体的转变,将是一种新的尝试。
研究发现,乳酸菌自身可以产生乳酸、乙酸等有机酸,这些酸类物质不仅可以与发酵过程中产生的醇、酮等进行反应产生风味物质[2]。还能改善面团内部面筋结构,提升面包的整体形态。如张怡芸等[3]研究发现添加乳酸菌发酵液可以加快面团发酵速度,显著改善面团的面筋网络结构,使得面包具有更好的组织状态。邵童等[4]以大豆作为原料,探究不同乳酸菌发酵豆乳对面团发酵特性的影响,结果表明添加发酵豆乳可以改善面团内淀粉酶活性,刺激面筋蛋白降解,提高面包面团的延展性和蓬松度。钟京等[5]在高纤维面包中添加乳酸菌发酵的麸皮,发现能提高面包面团产气能力并改善面团持气性。近年来,关于不同乳酸菌发酵基质对面包品质影响的研究备受学者关注,研究重点大多集中于谷物、豆类或无面筋体系的探索[6],关于薯类基质相关的研究鲜见报道。
基于此,本研究将芋泥进行乳酸菌发酵,并将其添加到面团中制作面包,探究乳酸菌发酵芋泥内部产物变化及发酵活力,测定面团粉质特性和流变特性变化,对面包的质构特性和发酵结果进行分析,以期实现芋泥从面包辅料到面制品主体原料的突破。
荔浦芋:广西北流寻味君农业有限公司;红芽芋:江西省江天农业科技有限公司;白砂糖、盐,市售食品级;TR22 型植物乳杆菌:镇江市天益生物科技有限公司;黄油:中粮集团有限公司;酵母:安琪酵母股份有限公司;高筋面粉:江苏新良面粉有限责任公司;德氏乳杆菌培养基(MRS培养基):苏州百思生物技术有限公司;乳酸、乙酸、葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖等标准样品:美国Sigma 公司,所使用的化学品均为分析级。
HVS-1000 型超净工作台:苏州安泰仪器设备有限公司;FE-20x 型pH 计:梅特勒(上海)公司;BRF-18C 型发酵箱:广州展卓商用设备制造有限公司;YCD-1D 型烤箱:广州荣麦烘焙食品机械制造有限公司;Waters 1525 型高效液相色谱仪:美国沃特世公司;DHR-2 型流变仪:美国TA 仪器有限公司;TEE32 型物性测定仪:英国Stable Micro System 公司;Farinograph-E 型粉质仪:德国布拉本德公司。
选择优质、无病虫害、个大均匀的荔浦芋和红芽芋,洗去表面的泥沙等杂质,去皮切片,隔水蒸煮45 min 熟化,按照荔浦芋与红芽芋添加量比值为3∶1,打浆机制成芋泥,加入10.0%的蔗糖混合均匀。取1.0%TR22 型植物乳杆菌直接加入,37 ℃恒温培养箱中培养12 h,制得发酵芋泥备用。
1.3.1 发酵过程中菌落总数、pH 值和可滴定酸的测定
取10.00 g 不同发酵时长的芋泥在90.0 mL 无菌生理盐水中混匀,进行梯度稀释。将100.0 μL适宜浓度稀释液涂布于MRS 固体平板上。37 ℃培养24 h,观察平板菌落的生长情况并进行记数。
参考Katina 等[7]的方法,将10.00 g 不同时长发酵芋泥和90.00 mL 去离子水混合搅拌30 min,静止10 min 测样品pH。可滴定酸(Total titratable acid,TTA)为0.10 mol/L NaOH 溶液滴定样品,当pH=8.60 时,消耗的滴定体积(mL)。
1.3.2 乳酸和乙酸测定
参照Tang 等[8]的方法,称取1.00 g 发酵芋泥冻干粉,加入4.00 mL 去离子水,在4 ℃下高速匀浆 30 s。将稀释液在 4 ℃下 8 000×g 离心10 min。取适量上清液过0.45 μm 滤膜,用于高效液相色谱法测定样品中乳酸和乙酸的含量。色谱条件为:Ecosil C18 柱、柱温30 ℃、紫外(UV)检测器(波长为210 nm)、流动相(甲醇:95%,v/v)、流动相pH 用磷酸调至3.0,流动相流速为0.80 mL/min、进样量为10.00 μL。
1.3.3 胞外多糖、单糖、二糖测定
胞外多糖(Exopolysaccharides,EPS)含量测定参照Tang 等[8]的方法。将1.00 g 发酵芋泥冻干粉与离子水(1∶2)稀释,在4 ℃下以8 000 g离心20 min。在4 ℃下,加入4%(w/v)的三氯乙酸沉淀蛋白质,时长约 12 h,然后通过离心(4 ℃,8 000 g,30 min)去除沉淀的蛋白质。向上清液中加入三倍体积的冰乙醇(95%,v/v)并离心(4 ℃,8 000 g,30 min)。将沉淀复溶于1.0 mL 去离子水中,每8 h 换一次水,在4 ℃下透析48 h。根据苯酚硫酸法测定透析后的EPS 溶液中多糖的含量,加入现配的 6%苯酚溶液0.50 mL 震荡2 min,再加入2.50 mL 浓硫酸(98%,v/v)震荡5 min,将反应后的混合液置于室温冷却30 min。样品在490 nm 波长测定其吸光度,并使用不同浓度葡萄糖溶液制作标准曲线[7]。
单糖和二糖含量的测定参照Vallabha 等[9] 的方法。取冻干后的发酵芋泥粉4.0 g 用12.00 mL去离子水在4 ℃下,200 r/min 恒温振荡提取1 h。然后离心(4 ℃,8 000 g,5 min),取上清液置于100 ℃水浴加热5 min,冷却至室温后离心(10 000 g,30 min)取上清液过滤膜(0.22 μm)用于高效液相色谱仪(High performance liquid chromatography,HPLC)测定样品中的单糖和二糖含量。色谱条件为:XBridge BEH Amide 柱的尺寸排阻高效液相色谱(Size exclusion high performance liquid chromatography,SE-HPLC)液相系统,柱温30 ℃,示差检测器,流动相(乙腈:70%,v/v),流速0.80 mL/min,进样量为10.00 μL。
1.3.4 游离氨基酸含量测定
游离氨基酸含量的测定参考武盟等[10]的方法。将2.00 g 冻干发酵芋泥与25.00 mL 5%三氯乙酸混合,30 min 超声波提取,10 000 g 离心10 min 后使用两层滤纸过滤,上清液10 000 g 离心10 min 后用邻苯二醛进行柱前衍生,然后使用HPLC 进行游离氨基酸分析[11]。色谱条件为:ODS Hypersil 色谱柱、柱温40 ℃、紫外检测器(波长为338 nm)、流动相(甲醇∶乙腈∶醋酸钠=1∶2∶2(v:v:v))、流速为1.00 mL/min、进样量为10.00 μL。
面包面团配方以小麦粉100 g 为基准,将芋泥以质量分数5%、10%、15%的添加量来替代小麦粉,同时添加糖10%、盐1%、黄油5%、酵母2%制作面团。测定芋泥面团含水量,使得面包配方加水量保持一致,均为60%。将未添加芋泥及发酵芋泥样品为空白组,添加芋泥样品为对照组,添加发酵芋泥样品为实验组。使用和面机和面20 min 取出,室温下松弛10 min。将每个面团分割30.00 g/个,在醒发箱内(32 ℃、相对湿度82%)醒发1.5 h,烤箱上/下火温度为200/190 ℃,烘焙7 min 制得面包,冷却至室温后进行测试。
1.4.1 面包面团的粉质特性测定
参考GB/T 14614—2019 粮油检验小麦粉面团流变学特性测试粉质仪[12]。
1.4.2 面包面团的流变特性测定
使用带有40 mm 平行板探头的流变仪进行测定,取5.00 g 面团按压成面片,流变仪两平板间的距离为1 mm,测试温度设置为25 ℃,压片至1 mm 后进行刮样并涂抹硅油减少水分挥发,待平衡3 min 后进行频率扫描。频率扫描测定:应变振幅为0.5%,温度为25 ℃,频率设定为0.1%~10%。测定面团的储能模量Gʹ、损耗模量Gʺ。
1.4.3 面包比容和损失率测定
面包比容参考张凤婕等[13]的方法,用小米替换法进行测定。
通过计算烘烤前的面团和烘烤后的面包的重量来测定烘焙损失率,计算公式(1)如下:
1.4.4 面包质构测定
面包室温冷却2 h,取中间2 片切成2.00 cm×2.00 cm×1.50 cm 的立方体,采用P50 探头进行全质构测试(Texture profile analysis,TPA)测试,测前、后速度3.00 mm/s,测定速度2.0 mm/s,压缩比例50%。
1.4.5 面包芯气孔成像分析
面包切成5.00 mm 厚的薄片,通过图像扫描仪得到面包图像,用Image J 进行分析。图像分辨率:300 dpi,取图区域:3.00 cm×3.00 cm。气孔稠密度(Cell density,CD)表示单位面积发酵芋泥面包所含有的瓤芯气孔个数。
气孔表面积分率(Area fraction,AF)表示为面包瓤芯气孔总面积与扫描面包瓤芯总面积的百分比,可间接反映面包产生CO2 的能力以及持气稳定性。
所有测试指标均进行 3 次平行测试。使用Excel 2021 进行数据处理,SPSS Statistics 25 进行统计分析,并采用Origin 2022 进行作图,实验显著性水平P<0.05,数据差异显著。
2.1.1 菌落总数和pH 值、TTA 的变化
如图1 所示,前6 h 是乳酸菌的延迟期,菌落总数增长缓慢。在6 h 至10 h 为乳酸菌的对数生长期,在发酵10 h~16 h 内乳酸菌进入稳定生长期,最高菌落数可达8.39×106 CFU/mL,16 h 后菌落数不再增长,出现下降趋势。这可能是在发酵后期,pH 逐渐降低,酸度不断累积,低于微生物的承受范围导致菌体死亡。另一方面发酵过程中会消耗大量的营养物质,发酵16 h 后的发酵环境已不利于菌体的生长,菌体逐渐衰亡。
图1 发酵过程中菌落总数的变化
Fig.1 Changes of cell count of LAB during fermentation
由图2 可知,乳酸菌发酵芋泥pH 和TTA 为负相关。在10 h 内乳酸菌将发酵芋泥迅速酸化,这是由于此时的乳酸菌大量繁殖,产酸能力较强引起的。发酵芋泥从初始pH 值6.50 经过12 h 发酵后,降至4.60~4.70,这和菌落总数的增加趋势是一致的。在发酵后期pH 保持稳定波动。与之相反的是,发酵芋泥的TTA 值与发酵时间呈正相关变化趋势,初始TTA 值1.2 mL 发酵20 h 时增加到4.40 mL,其上升是由于乳酸菌在不断进行新陈代谢与产酸作用[14],这也可以刺激其内部酶活性,加快形成氨基酸和糖类物质,利于面包面团的优化。
图2 发酵过程中pH、TTA 的变化
Fig.2 Changes of pH and TTA during fermentation
2.1.2 乳酸乙酸的变化
表1 可以看出,发酵芋泥在发酵结束后的乳酸、乙酸含量显著性增加,这与pH 值测定结果相同。有机酸起到降低面团pH 值并激活发酵体系中的酶等作用,进而影响各项特性[14]。如有机酸会将淀粉颗粒酸解,软化面筋,增强面团的吸水性,提高面团的弹性和柔软性;有机酸的增加还能抑制致病菌的生长繁殖,延长面包的货架期。未经发酵的芋泥乳酸及乙酸值极低,在经乳酸菌发酵结束后,乳酸大幅度增加至5.21 mg/g、乙酸增加至4.96 mg/g,由此证明发酵芋泥可以同时促进乳酸及乙酸的积累,这与周一鸣等[15]研究结果一致。植物乳杆菌属于兼性异型发酵菌株,其利用内部的己糖和戊糖发酵产生乳酸,后进行戊糖磷酸反应产生乙酸[16]。发酵熵(Fermentation quotient,FQ)为乳酸与乙酸的含量比,在未发酵前乳酸产量略高于乙酸,在发酵结束FQ 下降,说明乳酸和乙酸的含量差距缩小,乙酸的增加使其可以赋予面包更丰富的风味。
表1 发酵过程中有机酸含量的变化
Table 1 Changes of organic acid during fermentation
注:同列不同字母表示差异显著(P<0.05),下表同。
Note: Different letters in the same column indicated significant differences (P<0.05), same as below.
样品 乳酸/(mg/g) 乙酸/(mg/g) FQ未发酵芋泥 0.05±0.00b 0.03±0.01b 1.59±0.25a发酵芋泥 5.21±0.10a 4.96±0.11a 1.05±0.03b
2.1.3 糖代谢的变化
芋泥糖代谢情况见表2,未经发酵芋泥中可溶性糖仅含蔗糖和麦芽糖,且蔗糖含量占可发酵糖总量的37.92%,由此推断,蔗糖是发酵过程中主要能量来源。在发酵后期,蔗糖分解伴有麦芽糖与果糖的生成,乳酸菌对蔗糖的利用率显著,可达86.10%。发酵后芋泥EPS 增长到2.38 g/kg,乳酸菌以蔗糖作为供体,通过葡萄糖基转移酶合成葡聚糖,进而增加EPS 含量,大量糖类和低酸环境使得乳酸菌更倾向于合成EPS 来增强自我生存能力[17],EPS 有强大的乳化能力,可以很好地改善面团内部组织架构,使得面包组织状态细密均匀。
表2 发酵过程中糖代谢变化
Table 2 Changes of sugar metabolism during fermentation
注:-表示未测出。
Note: - indicates not measured.
可发酵糖/%样品蔗糖 麦芽糖 果糖EPS/(g/kg)未发酵芋泥 37.92±1.76a 1.47±0.05b - 1.43±0.06a发酵芋泥 5.28±0.42b 2.38±0.11a 1.15±0.08a 2.38±0.09a
2.1.4 游离氨基酸含量的变化
游离氨基酸是乳酸菌发酵分解蛋白和代谢糖类等能源物质,产生的一种对最终产品的风味、营养与感官品质都具有重要影响[18]的代谢产物。如表3 所示,乳酸菌发酵使发酵芋泥的氨基酸整体含量有不同程度的提升,必需氨基酸含量相比发酵前提升了46%。其原因可能是酸性环境下蔗糖降解促进了有机酸的产生,进而激活芋泥中内源性蛋白酶的活性,促进多肽分解为游离氨基酸。作为风味物质的前体物质,游离氨基酸的增加可以优化面包整体风味和口感。
表3 发酵过程游离氨基酸变化
Table 3 Changes of free amino acid conten during fermentation mg/100 g
注:同行不同字母表示差异显著(P<0.05),*代表为必需氨基酸。
Note: Different letters of peers indicated significant differences (P<0.05), * represented essential amino acids.
氨基酸 未发酵芋泥 发酵芋泥Asp(天冬氨酸) 69.00±1.20b 97.00±4.50a Thr(苏氨酸)* 31.00±1.10b 48.00±1.60a Scr(丝氨酸) 61.00±0.40b 96.00±3.40a Glu(谷氨酸) 70.00±2.60a 78.00±5.50a Gly(甘氨酸) 3.00±0.20b 6.00±0.50a Ala(丙氨酸) 22.00±1.60b 39.00±1.45a Cys(缬氨酸)* 59.00±2.70b 84.00±4.16a Val(蛋氨酸)* 14.00±0.08b 23.00±1.51a Ile(异亮氨酸)* 38.00±2.12b 57.00±2.84a Leu(亮氨酸)* 51.00±2.10b 75.00±3.39a Tyr(酪氨酸) 42.00±1.79b 58.00±1.12a Phe(苯丙氨酸)*44.00±2.60b 63.00±4.20a Lys(赖氨酸)* 39.00±1.90b 54.00±3.90a His(组氨酸) 24.00±0.51b 34.00±1.87a Arg(精氨酸) 176.00±2.80b 225.00±5.97a Pro(脯氨酸) 9.00±0.24b 15.00±1.10a必需氨基酸 300 438
2.2.1 面团粉质特性和流变特性
粉质特性可以反映不同添加量芋泥及发酵芋泥对面包面团的加工性质。如表4 所示,未发酵芋泥的增加使面团的吸水率与稳定时间显著升高。吸水率和形成时间从空白组的 62.0%、10.06 min 增加至65.40%、18.90 min,原因是芋泥中蛋白质和膳食纤维较多,膳食纤维较面筋蛋白亲水性更强,会优先进行吸水膨胀直至水合完全后,水分子和面筋蛋白才开始进行相互作用,导致面团形成时间延长[19]。
表4 面团粉质特性的影响
Table 4 Changes of farinograph characteristics of dough
组别 吸水率/% 形成时间/min 空白 62.00±0.32d 10.06±0.24b 5%未发酵芋泥 63.50±0.56b 10.47±0.53b 10%未发酵芋泥 65.37±0.23a 12.73±1.09b 15%未发酵芋泥 65.40±0.52a 18.90±0.61a 5%发酵芋泥 62.37±0.33d 2.43±0.15c 10%发酵芋泥 62.23±0.19d 2.37±0.25c 15%发酵芋泥 62.70±0.45c 2.33±0.06c 稳定时间/min 弱化度/FU 19.15±0.21b 35.50±1.15a 22.83±0.74a 62.67±4.04c 22.87±0.27a 63.67±1.02c 22.67±0.61a 63.00±3.25c 18.37±0.50b 44.33±3.26b 16.07±1.30c 58.33±3.15c 14.53±1.60c 60.67±3.42c
由于乳酸菌的加入产生EPS,可以增大面团吸水率,而酸化作用弱化面筋蛋白结构,减少纤维与面筋之间的吸水竞争,降低吸水率,二者相互作用使得添加5%和10%发酵芋泥组的吸水率和空白组相比无显著性差异。弱化度代表面团内部面筋的耐破坏程度。未发酵芋泥弱化度高于空白组和发酵芋泥组,说明添加未发酵芋泥可导致面团面筋弱,面团成品内部容易坍塌。
频率扫描结果如图3 所示,所有面团样品Gʹ和Gʺ存在频率依赖关系,且Gʹ大于Gʺ,表明面团样品的类固体行为占主导地位。Gʹ值越大,面团弹性越强,Gʺ值越大,面团粘性越强。面团Gʹ、Gʺ与添加发酵和未发酵芋泥量呈正相关。随着发酵芋泥加入,面团粘弹性出现显著下降,其中粘性下降趋势明显。结合面团的粉质实验结果,发酵芋泥的增加会在一定程度上弱化芋泥中淀粉分子与面团中面筋蛋白的交联能力,但维持面团的粘弹性不发生明显变化,这与Chochkov 等[20]研究一致。
注:(a)储能模量Gʹ;(b)损耗模量Gʺ。
Note: (a) storage modulus Gʹ; (b) loss modulus Gʺ.
图3 面团流变特性的变化
Fig.3 Changes of the rheological properties of dough
2.2.2 面包比容和损失率
影响比容因素有面团流变特性和CO2 的量等,芋泥中淀粉、膳食纤维含量丰富,会减少体系中的面筋含量,影响面包的稳定性,减弱持气效果。如图4 所示,在未发酵芋泥的添加量超过10%后,面包比容较空白组显著减小。加入发酵芋泥后,面包比容呈先升后降的趋势,并在10%添加量达到最大值。发酵芋泥内部的乳酸菌发酵使得CO2 积累,提高面团产气能力,面团内部pH值相对适宜,面筋结构软化使面团弹性增强,面包比容也随之增大。强酸环境下,面筋蛋白、淀粉等主要结构形成物会发生过度水解使面团产气过量,导致面包结构弱化,最终面包比容下降、损失率升高。
注:不同字母表示组别之间的差异显著(P<0.05)。
Note: Different letters indicated significant differences between groups (P<0.05).
图4 面包比容及损失率的变化
Fig.4 Changes of specific volume and loss rate of bread
2.2.3 面包质构
面包硬度增大表明面包干瘪、缺少弹性;黏着性变强表明面包内部更加黏着紧密,不利于醒发;咀嚼性增强表明入口所要施加的力更大,面包缺少绵软的口感,以上都是对面包品质的不利影响。如表5 所示,与空白组相比,添加未发酵芋泥的面包的硬度、黏着性有不同程度的升高。这是由于芋泥中存在大量淀粉和纤维,面筋结构较差。而添加发酵芋泥的面包硬度、黏着性、咀嚼性都显示出不同程度的下降趋势。添加量10%的发酵芋泥面包硬度较空白组降低28.74%、黏着性降低26.16%、咀嚼性降低38.58%。添加量超过10%后测定指标的数值均有所增加,证明发酵芋泥添加量为10%是最优组,推测过量发酵芋泥会对面包整体结构起反作用。
表5 面包的质构特性
Table 5 Changes of specific volume and loss rate of bread
组别 硬度/g 黏着性 咀嚼性空白组 195.61±14.23c 145.92±4.08b 133.55±2.42b 5%未发酵芋泥 198.07±6.73c 146.38±4.63b 133.68±3.83b 10%未发酵芋泥 218.12±8.87b 154.19±2.58b 135.29±5.32b 15%未发酵芋泥 237.32±13.57a 165.54±3.95a 147.14±6.70a 5%发酵芋泥 153.05±12.35d 104.27±7.98d 85.27±7.55d 10%发酵芋泥 139.39±11.35d 107.75±8.92d 82.02±4.29d 15%发酵芋泥 181.58±9.21c 130.71±5.25c 110.60±7.59c
2.2.4 面包瓤芯结构特性
不同面包瓤芯结构如表6 所示。CD 值与芋泥面包发酵时间、原料成分、和面搅拌过程及面筋蛋白与芋泥淀粉分子相互作用等方面有关,CD值相对越大,代表面包瓤芯组织结构越细腻。不同面包瓤芯结构如表6 和图5 所示,随着未发酵芋泥的添加,CD 值有不同程度的降低,这证明芋泥会对面包瓤芯结构有一定破坏。发酵芋泥的添加对面包瓤芯没有显著负面影响。空白组及发酵芋泥组的面包芯气孔呈较规则的长圆形孔隙,整体呈现致密均一的组织状态。与之相反的是加入芋泥的面包瓤芯气孔呈现不规则破裂空洞。
表6 不同芋泥面包瓤芯结构成像分析结果
Table 6 The results of image analysis of different taro paste bread crumb structure
面包 空白 5%未发酵芋泥 10%未发酵芋泥 15%未发酵芋泥 5%发酵芋泥 10%发酵芋泥 15%发酵芋泥 CD/(cell/cm2) AF/%74.31±5.60c 33.69±1.31a 45.21±2.71b 31.46±1.11a 51.83±1.99b 32.63±1.92a 32.04±4.18a 32.43±1.42a 71.84±0.49c 42.93±1.39b 74.08±3.25c 46.04±0.43c 73.66±4.23c 46.38±1.21c
注:a 为空白组,b~d 为添加未发酵芋泥组(依次为5%、10%、15%添加量),e~g 为添加乳酸菌发酵芋泥组(依次为5%、10%、15%添加量)。
Note: a is the blank group, b~d is the group with unfermented taro paste (in order of 5%, 10% and 15% addition), e~g is the group with lactobacilli fermented taro paste (in order of 5%, 10% and 15% addition).
图5 不同芋泥面包芯成像分析
Fig.5 Analysis pictures of different taro paste bread
芋泥经TR22 型植物乳杆菌发酵10 h 时迅速酸化,酸化程度高。与未发酵芋泥相比,发酵后的芋泥中乳酸、乙酸、糖代谢产物和游离氨基酸数量均显著性增大。将发酵芋泥加入面团中,可以使面团吸水性增强,面团弹性和柔软性得到提高,面筋蛋白交联能力得到弱化。此外,在面包中添加发酵芋泥有利于增加面包的比容大小,降低烘焙损失率,改善面包质地硬度、减少内部芯囊气孔个数。因此,添加发酵芋泥可以进一步优化面筋蛋白的构建能力,增加面团延长性,给予面包更多的营养物质,其中添加10%发酵芋泥对面包的优化效果最显著。
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Preparation of Taro Paste Fermented with Lactobacillus and Its Effect on Bread Quality