椒蒿（Artemisia dracunculus L）作为一种多年生蒿属类草本植物，具有抗菌、镇痛、愈合伤口、抗炎等能力[1]，可做调料和精油。椒蒿的地上部分可用于治疗各种消化系统疾病的症状，并作为痉挛性结肠炎疼痛的辅助治疗，在传统医学上椒蒿被用治疗胃炎、腹泻、风寒及开胃[2]。天然产物是活性成分的主要来源，自古以来因其药用价值而被广泛使用，研究表明精油对各种菌株有良好的抗菌活性[3]。精油除了作为抗菌剂被人们所使用外，还具有调节细菌耐药性的能力，可用于对抗表现出耐药性的微生物[4]。精油的化学成分和产量受气候条件、提取方式、土壤类型、品种和采收期等因素的影响，气候是影响精油成分和其中各化合物浓度的最重要因素之一，气候因素取决于地理位置，主要是植物生长地点的纬度和经度[5-6]，收获后采用的不同保存方法也会对其产生显著影响。
精油的不同成分在植物面对环境胁迫时起着十分重要的作用，研究表明，精油的生物活性会随收获季节的变化而变化，比如在春季分离的长叶薄荷精油的抗菌和抗胆碱酯酶活性值高于其他季节[7]，此外，精油的化学组成也会随生长季节产生差异[8]。Migacz 研究6 种桉树精油的季节性化学变化和生物活性评估时发现，不同桉树品种的化学成分存在差异性，但所有桉树精油的化学成分和产量均受到季节性的影响。Santos[10]评价了气候因素对P. acutangulum 果实和叶子中精油含量及化学组成的影响，对研究对象监测了一年后发现，气候因素与石竹烯有相关性，但与蒎烯、杜松醇并无相关性，而降雨量对精油含量的影响不大。Luz[11]等研究发现，植物精油的产率在干旱期要高于其他时期，尽管各生长期的主要化合物相同，但这些化合物的浓度和化学成分各生长期有所不同，一些物质则只在旱季产生比如芳樟醇、樟脑和β-可巴烯（5.05%）。药用植物的有效性取决于植物中存在的化学成分和活性成分，这些成分可能受到生长条件、季节、气候条件、太阳光照和海拔高度等不同因素的高度影响[12]。Arfa 等在对2 个迷迭香品种基于精油成分、抗氧化和抗菌活性的化学分类学评价研究中发现，相同品种和微生态气候环境条件下，气象条件的年度差异是引起精油和其他化合物产量变化的主要因素。因此，降雨、温度等气象条件会影响药用植物中精油及其主要化合物的含量。基于这种可能性，根据迷迭香精油的生长地点和收获日期来确定化学组成是研究精油生物活性的关键[13]。Larbi 在研究收获季节对柠檬精油化学成分和抗真菌活性的影响时发现，柠檬皮中的精油含量在秋季最高，而春季收获的精油抗皮肤癣菌活性最大[14]。研究表明，植物不同生长部位精油的化学组成及含量也存在差异性，Ilardi 等[15]在对“Foeniculum vulgare subsp. piperitum”的根、茎、叶、果实中精油化学成分进行研究时发现，不同生长部位的精油中主要的组成物质存在差异性。这一结论在Rawat[16]对苦姜不同生长部位精化学成分的研究中得到了证实。
椒蒿作为新疆特色野生植物，因其味道独特、营养价值高，深受人们喜爱，椒蒿的提取物具有一定的生物活性，这有利于其在医疗、美容、餐饮等行业的应用，然而目前缺乏生长时间对椒蒿化学成分及含量的研究，本研究旨在评价生长时间对椒蒿精油对化学成分的影响，利用气相色谱-质谱（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）对椒蒿精油化学成分进行检测，结合正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）和聚类热图探究生长时间与精油化学成分及相对含量间的关系，旨在为椒蒿产品开发利用和产业发展提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
研究对象为生长于海拔 1 883.0 m，东经80°41′9″、北纬41°43′51″的野生椒蒿。石油醚（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司。
1.2 仪器与设备
Agilent 7890/Agilent 5975 GC/MS 联用仪：美国安捷伦公司；研磨粉碎机A11 basic：德国IKA集团，索氏提取器：科伯实验仪器，旋转蒸发仪RV 10B：上海人和科学仪器有限公司，电子天平HD-G819：海达仪器。
1.3 实验方法
1.3.1 样品处理
选定特定生长地点采摘新鲜椒蒿嫩叶，在椒蒿生长的主要时间段4-6 月份，每15 d 采样一次，采摘时间为2023 年4 月1 日（S1）、2023 年4 月15 日（S2）、2023 年5 月1 日（S3）、2023 年5月15 日（S4）、2023 年6 月1 日（S5）、2023 年6 月15 日（S6），选择采摘时间的主要依据是在此时间段椒蒿鲜嫩可口，因其独特味道，深受消费者的喜爱。采用索氏提取器进行椒蒿精油提取，之后进行GC-MS 分析检测。
1.3.2 GC-MS 检测条件
载气为He（99.999%），1.0 mL/min；色谱柱为 HP-5 MS 5% Phenyl Methyl Silox（30 m×250 μm × 0.25 μm）弹性石英毛细管柱；进样口温度为250 ℃；进样量为1.0 µL，分流比为30∶1；升温程序：80 ℃保持2 min，以55 ℃/min 的速率上升到200 ℃，然后以10 ℃/min 的速率上升到300 ℃，保持10 min。接口温度为250 ℃，电离方式为EI；离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，电离电压为70 eV；质量扫描方式为Full Scan；扫描范围为 30 ～500 amu；用NIST05.LIB 谱库检索加以确认。
1.4 数据处理
GC-MS 检测出的椒蒿精油化学成分通过NISTMS Search 2.0 谱库来鉴别，各组分的相对含量采用面积归一化法进行确定，使用Origin 2024 软件进行离子流色谱图和聚类热图的绘制，OPLS-DA 采用SIMCA 14.1 进行分析，同时利用其计算变量投影重要性（Variable importance for the projection，VIP）值。
2 结果与分析
2.1 GC-MS 分析不同生长时间椒蒿精油化学成分变化
将不同生长时间（S1～S6）椒蒿精油进行GCMS 分析，通过NISTMS Search 2.0 谱库分析，利用面积归一化法从其总离子流图中计算各组分的相对百分含量，结果如表1 所示。图1 为不同生长时间椒蒿精油GC-MS 总离子流色谱图，根据色谱图保留时间、峰型和峰高将共有峰进行叠加，得到各采摘期的总离子色谱图，在生长发育过程中椒蒿精油中的化学成分含量及种类都存在差异。
图1 不同生长时间椒蒿精油GC-MS 总离子流色谱图
Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of Artemisia dracunculus L. at different growth stage
表1 不同生长时间椒蒿精油化学成分
Table 1 Chemical components of Artemisia dracunculus L essential oils at different growth times
注：同一行不同字母表示有显著性差异（P＜0.05）。
Note: Different letters in the same line indicated significant difference (P＜0.05).
相对含量/%序号 分子式 分子量 名称S1 S2 S3 S4 S5 S6 1 C10H16 136 β-蒎烯 0.17±0.02ab 0.12±0.03bc 0.09±0.03c 0.10±0.05c 0.20±0.03a 0.13±0.04c 2 C10H16 136 β-月桂烯 0.37±0.02a 0.38±0.03a 0.26±0.07b 0.35±0.05a 0.14±0.06c 0.02±0.02d 3 C10H16 136 D-柠檬烯 0.31±0.01a 0.22±0.05b0.19±0.03b 0.32±0.03a 0.08±0.01c 0.10±0.03c 4 C10H16 136 α-蒎烯 9.01±0.03b9.52±0.08a 1.42±0.11d 2.53±0.04c 1.12±0.35e 1.09±0.01e 5 C10H17 136 3-蒈烯 8.94±0.01a 9.12±0.02a 1.89±0.03b 2.03±0.22b 1.62±0.17c 1.15±0.14d 6 C10H18 136 萜品油烯 0.42±0.03a 0.25±0.05b0.22±0.06bc 0.24±0.06b 0.16±0.13c 0.18±0.03c 7 C15H24 204 δ-榄香烯 2.13±0.02b2.43±0.03a 0.58±0.06c 2.06±0.09b 0.40±0.08d 0.32±0.08d 8 C15H24 204 β-石竹烯 0.98±0.02b1.21±0.03a 0.98±0.17b 0.82±0.02c 0.14±0.07d 0.06±0.02d 9 C15H24 204 毕澄茄烯 1.44±0.11b1.65±0.03a 0.96±0.07c 1.01±0.02c 0.33±0.04d 0.27±0.05d 10 C15H24 204 β-柏木烯 0.48±0.01b0.52±0.03a 0.36±0.02c 0.19±0.02d 0.12±0.03e 0.06±0.02f 11 C30H50 410 何帕烯 0.55±0.01a 0.32±0.03b0.23±0.02bc 0.10±0.08d 0.26±0.09cb 0.19±0.07d 12 C15H24 204 β-律草烯 0.28±0.02a 0.15±0.04c 0.16±0.04b 0.17±0.03bc 0.06±0.02d 0.05±0.02d 13萜烯类C30H50 410 角鲨烯 1.14±0.01a 0.30±0.03b0.05±0.01e 0.19±0.02d 0.21±0.03cd 0.24±0.06c 1 C28H48O 400 菜油甾醇 0.21±0.02d0.32±0.04c 0.48±0.04a 0.40±0.01b － －2 C29H48O 412 豆甾醇 2.63±0.05a 0.26±0.02c 0.35±0.05c 0.89±0.20b － －3 C29H48O 412 β-谷甾醇 2.35±0.09e 3.59±0.06d5.38±0.02b 8.09±0.23a 1.86±0.54f 4.23±0.08c 4 C29H50O 414 γ-谷甾醇 2.35±0.05e 4.17±0.06d9.16±0.07a 5.11±0.16b 2.33±0.15e 4.54±0.33c 5 C29H48O 412 岩藻甾醇 0.34±0.05d1.27±0.03a 0.60±0.02c 0.82±0.05b － －6 C20H40O 296 叶绿醇 0.33±0.09c 0.96±0.06b0.29±0.01c 1.65±0.19a － －7 C15H24O 220 桉油烯醇 0.15±0.01c 0.14±0.02c 0.29±0.07a 0.20±0.05b － －8 C22H46O 326 山嵛醇 0.12±0.02b0.18±0.04a 0.13±0.02b － － －9醇类C26H54O 382 十八硫醇 0.35±0.10b0.48±0.05a 0.11±0.22c － － －1 C29H50O2 430 α-生育酚 1.91±0.21b1.84±0.06b2.36±0.06a 1.59±0.06c 0.61±0.04d 0.49±0.04d其他2 C30H50O 426 β-香树精 0.21±0.09d1.13±0.09a － 0.39±0.03c 0.29±0.06d 0.58±0.07b 3 C12H16O3 208 榄香素 16.24±0.29b4.66±0.29d 17.54±0.40a 7.87±0.29c － －
整理出各生长时间共有物质25 种，其中萜烯类13 种、醇类9 种、其他物质3 种，除此之外在个别生长时间还检测出酯类、脂肪酸及酮类等物质。由表1 可知，萜烯类物质包括α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、角鲨烯、D-柠檬烯、β-律草烯、3-蒈烯、萜品油烯、毕澄茄烯、δ-榄香烯、β-石竹烯、β-柏木烯、何帕烯。
作为植物中的关键次生代谢产物，萜烯类物质具有很多功效，如Jefferson 等[17]在研究α-蒎烯对念珠菌的抗真菌作用时发现，α-蒎烯具有显著的抗真菌活性，对C. parapsilosis 具有较强的抑制活性，可有效抑制假菌丝等真菌结构，促进囊胚孢子的显著减少。β-蒎烯具有降血糖、降血脂和抗炎作用[18]，β-石竹烯是一种广泛分布于植物界的双环倍半萜烯，在香精油中具有独特的香气，在高等植物的生存和进化中具有重要的作用，对胃具有保护作用，对某些溃疡也有很好的治疗效果，因此它还具有治疗炎症和自身免疫疾病的前景[19]。同时β-石竹烯还具有降血脂[20]，抗癌、镇痛作用[21]。β-月桂烯具有抗焦虑、抗氧化、抗衰老、抗炎、镇痛和抗糖尿病等特性[22]。因此，萜烯类物质的存在是椒蒿具有药用价值，如抗炎、防腐杀菌、抗疟疾、抑制肿瘤活性等作用的主要原因。醇类物质是椒蒿精油中除萜烯类以外各生长时间检测出最多的共有化合物，包括菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、γ-谷甾醇、岩藻甾醇、叶绿醇、桉油烯醇、山嵛醇、十八硫醇等。
椒蒿精油中的主要化学成分有苯基丙烷衍生物、单萜、倍半萜类、二萜类、三萜类、聚乙炔、异香豆素类等化合物[23]，本实验中有些化合物未被检出的原因可能与椒蒿生长地点，气候条件有很大的关系，这一观点在Dylenova[24]对气候条件对青蒿（菊科）精油组成的影响研究中得到了证实。
2.2 不同生长时间椒蒿精油化学成分差异分析
为了更清楚地评估不同生长时间椒蒿精油之间的化学成分差异，对不同生长时间各化学成分含量进行了热图分析，如图2 所示。从热图中可以直观看出，大多数化学成分含量在S1 和S2较多，S3 和S4 次之，S5 和S6 最低。萜烯类物质整体呈现先下降后上升再下降的趋势，萜烯类物质总的相对含量在4 月份相对偏高，5 月份次之，6 月份最低，因此在5 月下旬之前采摘椒蒿并提取精油，萜烯类物质含量相对会较高。醇类物质在S4（5 月15 日）之前各生长时间含量相对较多，S4 之后相对含量变少，同时α-生育酚在S4 之前也是含量较多，之后变少。
图2 不同生长时间椒蒿精油化学成分环状热图
Fig. 2 Compound ring heat map of volatile compounds in Artemisia dracunculus L essential oil at different growth times
2.3 不同生长时间椒蒿精油化学成分的正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）
采用OPLS-DA 分析了椒蒿精油与生长时间的相关性，以26 种共有组分作为因变量，不同生长时间作为自变量，进行OPLS-DA 分析，模型的判别效果如图3（a）所示，自变量和因变量的拟合能力用R2X 和R2Y 表示，Q2 表示模型的预测能力，判断一个模型是否合格的标志是R2 和Q2 的值大于0.5，越接近1 证明拟合程度越好。图3（a）为OPLS-DA 得分图，R2X 为0.986，R2Y为0.999，Q2=0.99，证明该模型对不同生长时间椒蒿精油化学成分的预测能力很好。从图3（a）可以看出，不同生长时间椒蒿精油化学成分存在差异，该结果与热图分析结果一致，四月份的样品S1 和S2 分布在第一象限，五月份的样品S3和S4 集中在第二、三象限，六月份的样品集中在第四象限。
注：（a）：OPLS-DA 得分图（b）：置换检验图；（c）：VIP值图。
Note: (a): OPLS-DA scores; (b): replacement test; (c): VIP scores.
图3 不同生长时间椒蒿精油化学成分OPLS-DA 分析
Fig. 3 OPLS-DA analysis of chemical components in Artemisia dracunculus L essential oil at different growth times
对OPLS-DA 模型经过200 次置换检验就得到了图3（b），从图3（b）中可以看出，Q2 的回归线经过横轴与纵轴相交，且交点＜0，此结果说明OPLS-DA 模型不存在拟合的情况，证明其验证是有效的。可以作为鉴定不同生长时间化学成分的依据[25-26]。图3（c）为OPLS-DA 模型VIP 得分图，VIP 反映了每个组分表达模式的强度和解释能力，可用于每个样本组的分类和鉴别，从而协助标记组分的筛选（VIP 值＞1.0 通常用作筛选标准），VIP 值表示相关性，VIP 值越大，表示不同生长时间该组分的差异性越大。由图3（c）可知，共有5 种物质的VIP 大于1，分别为榄香素、α-蒎烯、3-蒈烯、γ-谷甾醇、β-谷甾醇，说明这5种物质是椒蒿精油在主要生长期（4—6 月份）的特征物质，后期在对椒蒿精油的分析鉴定中可以作为标志成分。
3 结论
以不同生长时间的椒蒿为研究对象，采用GC-MS 方法对不同生长时间的椒蒿精油进行分析检测，同时运用OPLS-DA 和聚类分析方式进行差异性分析。GC-MS 分析结果表明，各生长时间共有物质主要有萜烯类和醇类，烯烃类物质中含量相对较多的主要有α-蒎烯（9.52%～1.09%）、3-蒈烯（9.12%～1.15%）、δ-榄香烯（2.43%～0.32%）及毕澄茄烯（1.65%～0.27%），醇类物质中豆甾醇（2.63%～0.26%）、β-谷甾醇（8.09%～1.86%）、γ-谷甾醇（9.16%～2.33%）含量相对较高；聚类热图分析结果显示，大多数化学成分含量在S1 和S2 较多。萜烯类物质整体呈现先下降后上升再下降的趋势，萜烯类物质总的相对含量在4 月份相对偏高。醇类物质在S4（5 月15 日）之前各生长时间含量相对较多，S4 之后相对含量变少，同时α-生育酚在S4 之前也是含量较多，之后变少；VIP 分析表明，共有5 种物质的VIP 大于1，分别为榄香素、α-蒎烯、3-蒈烯、γ-谷甾醇、β-谷甾醇。综上所述，在5 月下旬之前采摘椒蒿并提取精油，精油品质会更好。
本研究对不同生长时间椒蒿精油成分变化进行了分析对比，为椒蒿精油在生长过程中品质的动态变化提供了数据参考。但由于精油品质还可能受年度气候、生长海拔、干燥方式等因素的影响，需进一步了解影响因素与椒蒿品质间的互作关系，课题组后续将继续探究，以期为椒蒿的开发利用提供参考依据。
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