在面团体系中,淀粉被普遍认为是面筋网络结构中的惰性填料。然而,近年来研究发现,除了作为惰性填料外,淀粉和面筋蛋白之间的分子间相互作用也对面团的结构具有重要的调控作用,这种调控作用主要与淀粉的颗粒大小、来源、结构有关[1]。
Zhou 等[2]解释了不同粒径的马铃薯淀粉在冻融处理过程中对面团影响,粒径小的淀粉面团具有更高的分子间相互作用、更致密的结构、更低的水迁移率,这表明面团具有更好的抗性和更高的稳定性。Zhang 等[3]探讨了不同颗粒大小的马铃薯淀粉对面团特性的影响,发现小粒径马铃薯淀粉组成的面团表现出更紧凑和均匀的网状系统。Mu 等[4]研究不同植物来源(小麦、玉米、木薯、甘薯和马铃薯)淀粉的模拟面团结构特性,结果发现植物来源的淀粉在决定无麸质面团的流变特性方面起着积极作用,如小麦淀粉的添加使无麸质模型面团更柔软,但降低了网络稳定性;马铃薯淀粉的添加增加了面团的抗变形性、粘度和回生率。不同植物来源淀粉对面团的吸水率、流变特性有不同程度的影响,这主要与模拟面团中淀粉-面筋相互作用有关[5]。
热处理是面团加工的一个初步处理条件,通常伴随着淀粉的糊化和蛋白的变性,这是面团加工品质形成的基础。已有研究表明,热处理能够增强面团中淀粉与蛋白质大分子之间的非共价相互作用,进而影响面筋蛋白在热处理过程中肽链之间的交联以及蛋白大聚体结构的稳定性[6]。Zou等[7]通过研究小麦粉面团在湿热处理后对饼干品质的影响,发现在高温处理下,湿热处理的面筋蛋白显著变性,严重破坏了模拟面团的面筋网络,同时提高了面团的变形性。Lin 等[8]的研究也表明了热处理可以改变淀粉和面筋蛋白之间的相互作用,同时有利于处理组的二硫键生成,生成更多高分子量蛋白质,提高了面筋网络的稳定性。因此,在热处理过程中,淀粉和面筋蛋白网络之间的相互作用对面团品质具有重要影响。然而,目前不同淀粉结构对面团品质调控作用的相关研究信息较少,无法对面制品的精准加工提供有效控制手段。因此,本研究旨以固定比例(淀粉与面筋蛋白比例为86∶14)混合不同结构的玉米淀粉(高直链、普通和蜡质玉米淀粉)与面筋蛋白来制备模拟面团,并对经过热处理后的不同模拟面团的流变特性、热特性、微观结构以及面筋蛋白的物化特性进行表征,明晰不同结构淀粉诱导的面筋蛋白结构转变与面制品品质特性之间的构效关系,以期从淀粉特性的角度来调控面团的加工品质。
普通玉米淀粉、直链玉米淀粉、蜡质玉米淀粉、面筋蛋白、还原型谷胱甘肽(Reduced glutathione,GSH):上海源叶生物科技有限公司;异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)、罗丹明B:美国Sigma-Aldrich 公司;5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(5,5’-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid), DTNB)、乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA):上海麦克林生化科技有限公司;氯化钠(NaCl)、尿素(Urea)、溴化钾(KBr,光谱纯):天津科密欧化学试剂有限公司;十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)、二硫苏糖醇(Dithiothreitol,DTT):上海生工生物工程有限公司。
Haake-Mars 60 型流变仪:德国 Thermo Scientific 公司;Q2000 差示扫描量热计:美国TA公司;FEI Q45 扫描电子显微镜:美国FEI 公司;FV101 激光共聚焦扫描显微镜:日本Olympus 公司;Vertex 70 傅里叶红外光谱仪:德国Bruker 公司;HR/T20MM 立式高速冷冻离心机:湖南赫西仪器装备有限公司。
1.3.1 玉米淀粉模拟面团的制备
使用高直链玉米淀粉、普通玉米淀粉和蜡质玉米淀粉与面筋蛋白以固定的比例(84∶16)混合,加水量为50%,制备三种不同玉米淀粉的面团,揉成面团,并在95 ℃条件下蒸制30 min备用。
1.3.2 面团流变学特性的测定
根据Kuang 等[9]描述的方法,使用Haakemars 60 型流变仪评估面团的流变行为。分别从三种面团上切下一块,放在直径35 mm,间隙2 mm的平行板之间,刮去板外多余的面团,迅速把硅油涂抹在面团周围,以防止测试过程中面团中的水分流失。首先,在25 ℃下将面团平衡5 min,然后以4 ℃/min 的速率将温度升至95 ℃,在0.1%的恒定应变下进行温度扫描。并记录储能模量(G′)和耗能模量(G″)随温度变化的情况。
1.3.3 面团热特性的测定
参考李等[10]所做实验,用差示扫描量热计(Differential scanning calorimeter,DSC)表征热性能。首先面团样品进行冷冻干燥后,准确称重10 mg 到铝制样品锅中。随后,将平底锅密封,以10 ℃/min 速度从50 ℃加热到110 ℃。使用软件记录蛋白变性和淀粉糊化的起始温度(To)、峰值温度(Tp)、结束温度(Tc)和焓(ΔH)。
1.3.4 面团微观结构的测定
1.3.4.1 扫描电子显微镜观察 将加热过的面团样品冷冻干燥处理,然后将样品放置在样品台上,喷金。在15 kV 的加速电压下,用扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)观察面团放大500×的微观结构[11]。
1.3.4.2 共聚焦激光扫描显微镜观察 将样品冷冻切成薄片,用异硫氰酸荧光素(FITC,0.02%,w/v)标记淀粉和罗丹明B(0.025%,w/v)标记蛋白质。用60×油透镜观察标记的样品。分别设定FITC 和罗丹明B 的激发/发射波长为488/518 nm 和568/625 nm,观察微观结构[12]。
1.3.5 化学相互作用
测定自由巯基含量参考Li 等[13]的方法,使用Ellman 试剂测定面团样品中游离巯基的含量。首先,在3.0 mL 反应缓冲液中添加含有30 mg 面筋蛋白的样品,25 ℃下振荡1 h,随后,添加0.3 mL Ellman 试剂充分混合均匀,置于黑暗条件下进行反应1 h,转速为10 000 r/min 离心15 min,取上清液测定412 nm 处吸光值。反应缓冲液配制:3 mM EDTA,1% SDS,8 M Urea,0.2 M Tris-HCl,pH=8.0,Ellman 试剂配制:溶于0.2 M Tris-HCl 的DTNB 溶液,pH=8.0。使用GSH 校准曲线计算自由巯基的含量,结果以mmol/g 蛋白质表示。
根据邝等[14]描述的方法检测离子键、氢键和疏水相互作用。含有面筋蛋白(0.6 g)的面团样品分别加入到S1、S2、S3 和S4 溶剂中,4 种溶剂分别是 0.05 M NaCl、0.6 M NaCl、0.6M NaCl+1.5 M Urea 和0.6 M NaCl+8 M Urea。在25 ℃下振荡 1 h 摇匀,再进行离心(转速:10 000 r/min)20 min,测定上清液中的蛋白质溶解度。S2 和S1、S3 和S2、S4 和S3 中溶解含量的差值分别代表离子键、氢键和疏水相互作用的强度。
1.3.6 面筋蛋白分子量分布
采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)对面筋蛋白的分子量分布进行测定。在室温下,取含有1 mg 面筋蛋白的面团,用含有5% DTT的样品缓冲液提取3 h,接着进行3 min 的沸水浴处理,冷却到25 ℃后,在转速10 000 r/min 和温度4 ℃下离心20 min。在恒定电流模式下,使用4%的浓缩胶和12%的分离胶进行电泳,电流分别是20 mA/gel 和40 mA/gel,分别取30 µL 3 种面团的上清液加入到泳道中。电泳结束后,将胶进行染色脱色处理[14]。
1.3.7 二级结构
根据Zhang 等[15]的方法,采用傅里叶变换红外光谱仪(Fourier transform infared spectrophotometer,FTIR)研究了面筋蛋白的二级结构。将热处理过的面团冻干并研磨成粉末,以1∶60 的比例将样品与固体KBr 粉末混合并压成片状。在4 cm-1 的分辨率条件下,扫描范围为400~4 000 cm-1,总计扫描64 次。用OPUS 7.2 软件对所得到的光谱进行基线校正和归一化。面筋蛋白二级结构是从酰胺I 区域(1 600~1 700 cm-1)通过傅立叶自去卷积和曲线拟合计算的。
实验数据经SPSS 19.0 软件进行显著性差异分析处理,结果使用均值±标准差表示,所有实验均重复测试3 次并计算平均值。显著性水平设定为P<0.05。同时,利用Origin 2022 软件绘制图形。
为探究面团的流变特性,对面团进行温度扫描。如图1 所示,不同类型的玉米淀粉面团的模量值整体随温度升高呈现先下降后上升,再下降的趋势。从25~60 ℃范围内,面团粘弹性减弱,且储能模量(G′)大于耗能模量(G″),面团固体特性占主导地位。这是因为一方面温度升高非共价键断裂,氢键被破环,面团结构崩解[9];另一方面,在加热过程中淀粉颗粒吸水膨胀,面团强度下降[16]。当温度由60 ℃上升至95 ℃时,面团开始糊化,面团的粘弹性快速升高并到达最大值后下降,此最大值为玉米淀粉糊化温度。这是由于温度继续上升,导致巯基氧化形成二硫键,面筋蛋白之间发生交联使粘弹性明显增强[13]。而后粘弹性下降则是温度的增加改变了分子的流动性,使得淀粉颗粒发生崩解,进而晶体结构发生熔化[17]。
注:(A):G′,(B):G"。
Note: (A): G', (B): G".
图1 不同类型玉米淀粉模拟面团的温度扫描结果
Fig.1 Temperature scan results of different types of corn starch simulated dough
显然,高直链玉米淀粉的加入增强了玉米淀粉模拟面团体系的粘弹性。面团里的水分分布在蛋白质网状结构中,相对于蜡质玉米淀粉,高直链淀粉具有更强的吸水性,能够吸附更多的水分子,可能面团中的水分分布发生改变,导致面团的机械强度增加,使面团的G′和G″提高[18]。
采用差示扫描量热法测定模拟面团的热特性,由图2 A 可知,普通玉米淀粉-面筋蛋白和蜡质玉米淀粉-面筋蛋白面团的DSC 曲线趋势基本一致,有两个吸热峰,这被认为与面筋蛋白热变性和淀粉糊化有关。高直链玉米淀粉-面筋蛋白的面团只有一个吸热峰,这是面筋蛋白变性的结果。由于高直链玉米淀粉模拟面团含有高含量的直链淀粉,导致其面团更难糊化,这是与普通/蜡质玉米淀粉模拟面团在吸热峰上产生显著性差异的原因[19]。图2B中高直链玉米淀粉面团的Tp1和ΔH1显著高于其他两组,因为Tp1和ΔH1越大面筋蛋白热稳定性越高,聚集程度越大,因此高直链玉米淀粉面团的面筋蛋白稳定性最高[20]。糊化的起始温度是衡量淀粉是否容易糊化的重要指标。由图2 B 可知,蜡质玉米淀粉面团糊化起始温度显著小于其他两组,而糊化的起始温度越小,淀粉颗粒越容易吸水膨胀[21],因此蜡质玉米淀粉面团更易糊化。
注:(A):DSC 模式,(B):变性温度范围示意图和焓转变数据。同一指标不同类型玉米淀粉面团上的不同小写字母表示差异显著(P<0.05),下同。
Note: (A): DSC mode, (B): Denaturation temperature range diagram and enthalpy transition data. Different lowercase letters on different types of corn starch dough of the same index indicate significant difference (P<0.05), the same as below.
图2 不同类型玉米淀粉模拟面团的热性能
Fig.2 The thermal properties of different types of corn starch simulated dough
2.3.1 扫描电子显微镜分析
通过SEM 观察了加热后含不同直支链比玉米淀粉面团的微观结构。结果显示(图3)高直链玉米淀粉的颗粒形状为椭圆或球状,其平滑度显著高于蜡质、普通玉米淀粉颗粒,且直链淀粉占比越大玉米淀粉的颗粒越小。加热后,蜡质玉米淀粉颗粒易吸水膨胀,与面筋蛋白网络结构变得不连续,而含有高直链淀粉的面团形变较小,这与面团热特性结果相同,同时有实验也证明了此结果[22]。
注:A、B 和C 分别表示蜡质玉米淀粉模拟面团、普通玉米淀粉模拟面团和高直链玉米淀粉模拟面团。
Note: A, B and C represent waxy corn starch simulated dough, ordinary corn starch simulated dough and high amychain corn starch simulated dough, respectively.
图3 不同类型玉米淀粉模拟面团加热后的SEM 图像
Fig.3 SEM images of different types of corn starch simulated dough after heating
2.3.2 共聚焦激光扫描显微镜分析
为了进一步研究不同直支链比淀粉对面团微观结构的影响,使用共聚焦激光扫描显微镜(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)观察面团结构,图4 显示了由蛋白质(红色)和相互分散的淀粉颗粒(绿色)组成的网络。对于三种类型面团,分散的面筋蛋白网络包裹着淀粉颗粒[12]。在含有较高水平直链玉米淀粉的面团中,淀粉颗粒的聚集更为明显,蛋白质链厚度更大。直链淀粉颗粒的聚集可能导致其在蛋白质中分散性差,这可能是在面筋网络内形成较厚的蛋白质链的原因。颗粒-颗粒相互作用的增加可能导致含有聚集直链淀粉区域的局部剪切增稠[12]。
注:图中红色和绿色分代表面筋蛋白和淀粉颗粒。
Note: The red and green sections represent gluten and starch granules.
图4 不同类型玉米淀粉模拟面团加热后的CLSM 图像
Fig.4 CLSM images of different types of cornstarch simulating dough after heating
二硫键、离子键、氢键和疏水相互作用对维持面团的结构起着重要作用,其中二硫键是维持面筋蛋白网络结构的主要共价键[23]。在本研究中,高直链玉米淀粉面团中的自由巯基含量显著低于其余两组,在蜡质面团中自由巯基含量多(图5A),这可能蜡质淀粉的存在抑制了面筋中二硫键的形成,从而导致蛋白质之间的结合被弱化。随着二硫键数量的增加,面团的面筋蛋白网络更稳定[24]。
注:(A):自由巯基含量和离子键的变化(B):氢键和疏水相互作用的变化。
Note: (A): Changes in free thiol content and ionic bonds. (B):Changes in hydrogen bonding and hydrophobic interactions.
图5 加热后不同类型玉米淀粉模拟面团的自由巯基、化学键和疏水作用的变化
Fig. 5 Changes of free sulfhydryl group, chemical bond and hydrophobic action of different types of corn starch simulated dough after heating
当玉米淀粉类型发生改变时,离子键和疏水相互作用的含量没有显著差别,其含量一致保持在0.24 mg/mL 和7.73 mg/mL 左右,表明在加热过程中二者几乎不参与淀粉和面筋蛋白的相互作用。氢键是维持蛋白质二级结构的重要作用力,其键合力较弱,在95 ℃热处理条件,氢键易断裂,然而氢键含量在高直链淀粉的面团中最高(图5 B),提高了面团弹性[25]。
采用还原型和非还原型聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了不同直支链淀粉比对面筋蛋白的聚集行为。在非还原型聚丙烯酰胺凝胶电泳模式下(图6 A),在A1 区域主要含有面筋蛋白聚集体,A2 区域以及A3 区域主要是γ-醇溶蛋白、α/β-醇溶蛋白、低分子量谷蛋白和盐溶性蛋白,显然图6 A 中,蜡质玉米淀粉面团中的低分子量蛋白含量多,高分子量蛋白含量少,与面团中的二硫键含量对应,蜡质玉米淀粉面团中二硫键含量最少,蛋白聚集程度低。这可能是蜡质淀粉易吸水膨胀,形成“空间位阻”效应,阻碍面筋蛋白之间的交联。另一方面经过加热,蜡质淀粉表面相对于普通和高直链淀粉对面筋聚合物具有较高的粘附性,这些物理吸附作用导致面筋蛋白之间的交联减少,从而抑制了蛋白聚集的形成[26]。
注:(A):非还原条件,(B):还原条件;M 代表标准分子质量;1、2 和3 分别代表普通玉米淀粉模拟面团、高直链玉米淀粉模拟面团和蜡质玉米淀粉模拟面团。
Note: (A): Non reducing conditions, (B): reducing conditions; M represents the standard molecular weight; 1, 2 and 3 represent ordinary corn starch simulated dough, high amylose corn starch simulated dough, and waxy corn starch simulated dough, respectively.
图6 不同类型玉米淀粉模拟面团中面筋蛋白的SDS-PAGE 图谱
Fig.6 SDS-PAGE map of gluten protein in simulated dough of different types of corn starch
由还原聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱(图6 B)可以得出,经DTT 还原后,分子间二硫键断裂,导致3 种面团蛋白的分子量分布基本没有差别。并且,B1 区域是以高分子量谷蛋白和面筋蛋白聚集体为主,不同类型面团之间条带没有差别,表明面筋蛋白和淀粉之间的相互作用不存在共价键[27-28]。
面筋的二级结构可以通过分子间β-折叠、β-折叠、无规则卷曲、α-螺旋和β-转角的含量来表征,图7 A~B 显示了面筋蛋白的FTIR 光谱和酰胺I 带的反卷积结果,在波长为1 600~ 1 700 cm-1处,这段吸收峰因C==O 双键(70%~ 85%)和C—N(10%~20%)基团的拉伸振动形成。如图7 A所示,显示了不同二级结构的含量,3 种面团红外图谱的趋势相似,表明没有产生新的结构[29]。且面筋中酰胺I 带的典型分解图如图7 B 所示,基线校正和高斯平滑后通过反卷积获得 5个分量。
注:(A):FTIR 光谱,(B):酰胺I 带的反卷积结果。
Note: (A) FTIR spectrum, (B) deconvolution result of amide I band.
图7 不同类型玉米淀粉模拟面团中面筋蛋白二级结构分析
Fig.7 Secondary structure analysis of gluten protein in simulated dough of different types of corn starch
由表1 可知,面筋蛋白中β-折叠结构占主导地位,其含量在34%左右,Fan Ling 等[30]对β-折叠含量的研究结果在29%~34%范围,与本研究结果基本一致。蜡质玉米淀粉面团面筋蛋白的α-螺旋低于普通玉米淀粉面团和高直链玉米淀粉面团,并逐渐向β-转角转变,α-螺旋相较于β-转角更加有序和稳定[31],向β-转角结构转化越多,解聚程度越大,这可能与蜡质玉米淀粉对面筋蛋白聚集的抑制有关,与测定的分子量结果一致。
表1 不同类型玉米淀粉模拟面团中面筋蛋白二级结构含量的变化
Table 1 Changes of secondary structure content of gluten proteins in simulated dough of different types of corn starch
注:同一行不同小写字母表示不同类型玉米淀粉模拟面团的面筋蛋白二级结构之间存在显著差异(P<0.05)。
Note: Different lowercase letters in the same row indicated that there were significant differences in the secondary structure of gluten protein of different types of corn starch simulated dough (P<0.05).
二级结构 蜡质玉米淀粉面团/% 普通玉米淀粉面团/% 高直链玉米淀粉面团/%分子间β-折叠 5.58±0.52c 6.22±0.04ab 6.50±0.33a β-折叠 28.44±0.06a 28.35±0.02ab 28.41±0.08ab无规则卷曲 15.06±0.46c 16.33±0.11a 16.35±0.14a α-螺旋 18.75±0.08c 19.17±0.00ab 18.97±0.08bc β-转角 32.17±0.96a 29.93±0.13b 29.76±0.47b
综上所述,不同结构玉米淀粉会不同程度影响面团的物化特性。在加热过程中,高直链玉米淀粉显著增强了面团的粘弹性,面筋蛋白的聚集程度更大,这主要与高直链淀粉较难糊化有关,从而为面团体系提供了更强的结构支撑。由于蜡质玉米淀粉更易糊化,在加热过程中与面筋蛋白竞争水分,抑制了面筋蛋白的交联,导致面团的粘弹性降低,这是淀粉糊化和面筋部分聚集的共同结果。总之,更高含量的蜡质玉米淀粉可以使面团的流动性和延展性更好,更有利于面团加工品质的调控。本研究为淀粉结构特性调节面团加工的控制策略提供了方法参考。
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Changes in Rheological, Thermal, and Structural Properties of Simulated Dough from Heat Induced Corn Starch