葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, GOD）是一种源自真菌的面粉品质改良酶制剂，在有氧条件下，利用氧气作为外部电子受体，特异性催化β-D-葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢可氧化面筋蛋白中的游离巯基基团，产生二硫化物交联即二硫键，起到增强面筋筋力的作用。黑小麦（Triticum aestivum L.）是科研单位采用不同的育种手段而培育出来的特用型的优质小麦新品种。黑色作物产品含有黑色素，因具有高营养、高滋补、高免疫之功能而身价倍增。其含有较丰富的蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、矿物质、花青素等，对人体降血脂、防治动脉粥样硬化、生长发育缓慢等具有重要意义[1]。黑小麦在生产应用与产品开发方面展现出巨大的潜力，与未来食品消费需求的发展趋势紧密契合。因为目前国内外对于黑小麦的研究主要集中在育种栽培和籽粒营养价值这两个方面，而已有研究[2-4]对于其产后加工和产品研发的探索尚显不足，所以有必要加强对黑小麦产后加工和产品研发的深入研究，以充分发挥其巨大的应用潜力。研究表明，黑小麦面筋蛋白的流变学特性以及强度相对较低，同时含有大量膳食纤维，这些因素共同导致黑小麦粉在形成面团时难以达到理想的黏弹性，从而限制了黑小麦加工产品的多样化开发[2]。
已有研究探讨了GOD 对小麦粉[5]、芽麦全粉[6]、荞麦粉[7]等面团特性的影响，并证实其能改善面筋蛋白、提升面团理化性质及加工产品品质，但关于GOD 对黑小麦粉面团面筋蛋白强度及面团理化性质的改善效果的研究报道仍较为稀少。因此，本文聚焦于研究GOD 对黑小麦粉面团物理特性，如糊化特性、热机械学特性、动态流变学特性和拉伸特性的影响，并从化学性质如蛋白质二级结构的角度、巯基与二硫键、蛋白质组分变化、麦谷蛋白大聚体含量变化以及微观结构给予解释，旨在深入探索GOD 对黑小麦粉面团特性的潜在改善作用，为黑小麦资源的增值利用和开发相关食品、提高其食用品质提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑小麦粉：优麦鲜（重庆）面业有限公司，符合GB/T 1355—2021《小麦粉》，粗细度过90 目筛。GOD（600 U/g，食品级）：山东隆科特酶制剂有限公司；蛋白定量测试盒：南京建成生物工程研究所。
1.2 仪器与设备
RVA-Tec Master 快速粘度分析仪：瑞典波通仪器公司；Mixolab 混合实验仪：法国肖邦公司；DHR-1 流变仪：美国TA 公司；TA.xt plus 质构仪：英国Stable Micro Systems 公司；Phenom 台式扫描电镜：荷兰Phenom 公司；Spectrum 100 傅里叶变换红外光谱仪：美国Perkin Elmer 股份有限公司；CHA-B 水浴恒温振荡器：常州亚特实验仪器有限公司；QL-861 涡旋混合器：海门市齐林贝尔仪器制造有限公司；MC 759 紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；5804 R 离心机：德国Eppendorf 公司；SY-10 真空冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司；FA 214 电子分析天平：上海豪晟科学仪器有限公司；K 9860 全自动凯氏定氮仪：山东海能未来技术集团股份有限公司；DHG-9070A 电热恒温鼓风干燥箱：上海齐欣科学仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 混合粉及面团的制备
在黑小麦粉中，添加不同浓度的GOD，以黑小麦粉质量分数计0%、0.2%、0.5%、0.8%、1.1%、1.4%。按照实验仪测定的最佳吸水率，向每个100 g 混合粉样品中加入 40 ℃的温水。经过10 min 的搅拌和面后，将面团用保鲜膜包裹并静置30 min 备用。
1.3.2 混合粉糊化特性测定
参考GB/T 24853—2010《小麦、黑麦及其粉类和淀粉糊化特性测定快速粘度仪法》，为了测定混合粉的成糊特性，将3.49 g 的混合粉和25 mL的水转移至干燥且清洁的样品筒中。随后，迅速进行搅拌以实现均匀分散，最后再利用快速粘度分析仪对混合物的成糊特性进行精确测定。
1.3.3 面团热机械学特性测定
参考MOZA 等[8]的方法并适当修改。和面转速保持80 r/min，调整混合粉重量和加水量使目标扭矩C 1 值保持在（1.10±0.05）N·m，面团重量默认75 g，水分基准默认湿基14%，水箱温度为30 ℃。
1.3.4 面团动态流变学特性测定
参考LI 等[9]的方法并适当修改。采用PP 25圆形检测探头，间距设置2 mm，取1.3.1 制备的面团中心样品约3 g 进行测定。设定平衡时间5 min 以消除残存应力，温度25 ℃，应变振幅0.1%，每数量级点数取5，在0.1～20 Hz 扫描频率范围进行频率扫描。
1.3.5 面团拉伸特性测定
参考Zia-ud-Din 等[10]的方法并适当修改。取1.3.1 制备的面团样品约30 g，置于质构仪面团制备槽，压制形成60 mm×2 mm 面团条，将面团条置于质构仪测试区域内，用A/KIE 探头立即测定。
1.3.6 傅里叶变换红外光谱测定
参考杨明柳等[11]的方法并适当修改。将1.3.1面团样品真空冷冻干燥，研磨过200 目筛以备用，取约100 mg 冻干样品粉末置于傅里叶变换红外光谱仪平台，采用反射扫描模式，用空气做背景扫描。
1.3.7 巯基与二硫键的测定
将1.3.1 面团样品真空冷冻干燥，研磨过200目筛以备用。取 150 mg 冻干样品粉末，参考YANG 等[12]的方法测定巯基与二硫键的含量。
1.3.8 扫描电子显微镜观察
参考LI 等[9]的方法并适当修改。将1.3.1 制备的面团切成长约20 mm，宽约3 mm，高约3 mm的长方体样品，放入–40 ℃冰箱12 h，取出立即真空冷冻干燥（–70 ℃）12 h 以上，直至冷冻干燥完全。扫描电镜观察舱电压设定10 kv，放大倍数2 000 倍。
1.3.9 麦谷蛋白、麦醇溶蛋白及麦谷蛋白大聚体的测定
1.3.9.1 麦谷蛋白、麦醇溶蛋白含量测定 参考张令文[13]、张毅[14]的方法并稍作修改，将1.3.1面团样品真空冷冻干燥，研磨过200 目筛以备用。根据溶解性的不同依次提取蛋白质。
将各蛋白质提取液置于–20 ℃保存，采用蛋白定量测试盒测定各蛋白质含量。
1.3.9.2 麦谷蛋白大聚体的测定 取500 mg 冻干样品粉末于50 mL 离心管，加入10 mL 1.5%十二烷基硫酸钠，25 ℃磁力搅拌1 h，8 500 r/min 离心20 min，弃去上清液，沉淀重复提取2 次，小心刮下沉淀上层凝胶，采用全自动凯氏定氮仪测定麦谷蛋白大聚体含量。
1.4 数据处理
确保实验结果的准确性和可靠性，每个实验至少重复3 次，数据以平均值±标准差形式表示，利用SPSS 22.0 和Origin 2018 软件进行数据处理和作图，此外，采用Waller-Duncan 检验法显著性分析（P<0.05）。
2 结果与分析
2.1 黑小麦粉初始理化指标
经检测黑小麦粉主要成分为：水分（13.40±0.05）%、湿面筋（23.07±0.16）%、灰分（1.06±0.01）%（干基计，后同）、脂肪（2.61±0.23）%、蛋白质（13.07±0.14）%、淀粉（58.52±0.52）%、花青素（2.17±0.11）mg/100 g、多酚（21.18±0.19）mg/g、膳食纤维（6.42±0.29）%、戊聚糖（1.33±0.00）%。
2.2 GOD 对黑小麦粉成糊特性的影响
由表1 可知，随着GOD 添加量的增加，黑小麦粉的最终粘度呈现上升趋势，并在GOD 添加量达到1.4%时达到最大值。相较于未添加GOD的黑小麦粉，其最终粘度增加了11.16%。这一结果表明，GOD 的添加能够显著提升黑小麦粉的峰值粘度和最终粘度，这与黎芳等[5]的研究结果相一致。衰减值作为反映淀粉耐剪切性的指标，其数值越高，意味着淀粉的耐剪切性越弱[15]。适量添加GOD 可以使黑小麦粉淀粉体系的峰值粘度和最终粘度增大，同时使峰值时间和糊化温度升高，从而提升黑小麦粉淀粉的糊化稳定性，但GOD 的加入会减弱黑小麦粉淀粉颗粒的耐剪切性。
表1 GOD 对黑小麦粉糊化特性的影响
Table 1 Effect of GOD on the pasting properties of black wheat flour
注：同一列中不同字母表示显著性差异（P<0.05），后表同。
Note: Different letters in the same column indicated significant differences (P<0.05), same as below.
GOD 添加量/% 峰值粘度/cp 衰减值/cp 最终粘度/cp 0.0 2 514.50±16.26c 1 082.00±7.07d 3 758.00±0.00d 0.2 2 614.50±37.48ab 1 164.50±40.31c 3 869.50±70.00cd 0.5 2 661.00±11.31a 1 314.00±15.56b 4 061.50±13.44ab 0.8 2 616.00±31.11ab 1 387.00±7.07a 3 981.50±33.23bc 1.1 2 540.50±2.12c 1 336.00±22.63ab 3 890.00±91.92cd 1.4 2 579.50±40.31bc 1 312.00±43.84b 4 177.50±57.28a 峰值时间/min 糊化温度/℃5.47±0.00a 84.00±0.07d 5.57±0.05a 85.60±0.07bc 5.57±0.05a 86.40±0.07ab 5.57±0.05a 86.83±0.67a 5.50±0.05a 86.88±0.53a 5.50±0.05a 85.18±0.53c
粘度的增加可能与GOD 的氧化作用有关，该作用促进了蛋白质之间的交联聚集。这种交联聚集可能使原本游离于面筋蛋白结构之外的可糊化淀粉总量增加[16]。这一机制可能是导致黑小麦粉粘度上升的重要因素之一。另外，还可能是在GOD 作用下，产生的过氧化氢致水溶性戊聚糖氧化凝胶化，形成可溶性戊聚糖凝胶，从而增加面团粘度[17]。但过量的GOD 反而会使面团粘度下降[18]。
2.3 GOD 对黑小麦粉面团热机械学特性的影响
面团形成时间越长，表明面团稳定性越好；面团稳定时间越长，表明面团筋力越强[5]，蛋白质弱化度是衡量面筋强度的重要指标，其数值越低，表示面筋强度越高[18]，面团在搅拌过程中的耐受力也越强。由表2 可知，随着GOD 添加量的增加，黑小麦粉面团的形成时间与稳定时间呈现出先增后减的趋势，并在GOD 添加量为0.8%时达到最大值。这表明适量添加GOD 能够提升黑小麦粉面团的稳定性及面筋强度，从而强化面筋蛋白结构。这与孔晓雪等[19]的研究结果相一致。随着GOD 添加量的增加，黑小麦粉面团的峰值扭矩与最大粘度值也呈现出先升后降的趋势，并在GOD 添加量为0.8%时达到最大值。与未添加GOD 的对照组相比，这两个指标分别增加了7.93%和4.84%。这再次验证了GOD 的添加能够增大黑小麦粉面团的粘度，与上述表1 GOD对黑小麦粉粘度的影响结果一致。综合来看，GOD 的加入对黑小麦粉面团的热机械学特性有着显著的提升作用，尤其在GOD 添加量为0.8%时，这种提升效果最为明显。
表2 GOD 对黑小麦粉面团热机械学特性的影响
Table 2 Effect of GOD on thermo-mechanical properties of black wheat dough
GOD 添加量/% 吸水率/% 形成时间/min 稳定时间/min 峰值扭矩/N·m 蛋白质弱化度/N·m 回生值/N·m 最大粘度值/N·m 0.0 62.50±0.03a 1.18±0.01d 9.50±0.00e 3.53±0.20b 0.65±0.02a 1.04±0.01d 3.10±0.20a 0.2 62.50±0.02a 1.28±0.08d 10.65±0.07c 3.63±0.03ab 0.59±0.00b 1.05±0.01d 3.14±0.03a 0.5 62.45±0.04a 8.86±0.32b 11.75±0.35b 3.76±0.10ab 0.54±0.00d 1.14±0.02ab 3.21±0.11a 0.8 62.35±0.07a 9.64±0.05a 12.30±0.14a 3.81±0.02a 0.53±0.00d 1.16±0.03a 3.25±0.02a 1.1 62.35±0.04a 7.49±0.02c 10.40±0.00c 3.73±0.02ab 0.55±0.00cd 1.12±0.01bc 3.17±0.01a 1.4 62.30±0.07a 7.37±0.05c 10.00±0.00d 3.68±0.01ab 0.57±0.01bc 1.09±0.00c 3.15±0.01a
2.4 GOD 对黑小麦粉面团动态流变学特性的影响
由图1a 和图1b 可知，对于不同GOD 添加量的黑小麦粉面团，其储能模量（G'）和损耗模量（G"）均随着扫描频率的增加而增大。值得注意的是，在所有测试的频率范围内，面团的G'始终高于G"，这显示了面团的主导性质为弹性，并呈现出典型的黏弹性特征。
图1 GOD 对黑小麦粉面团储能模量（G'）、损耗模量（G"）、耗损角正切值（tan δ）的影响
Fig.1 The influence of GOD on storage modulus (G'), loss modulus (G") and loss tangent (tan δ) of black wheat dough
注：a-储能模量（G'）；b-损耗模量（G"）；c-耗损角正切值（tan δ）。
Note: a - energy storage modulus (G'); b - loss modulus (G"); c - dissipation angle tangent (tan δ).
损耗角正切（tanδ）是衡量面团黏弹性的重要参数。较小的tanδ 值意味着面团中高聚物的数量更多或分子聚合度更大，从而增强了面团的强度和综合黏弹性[20]。根据图1c，可以看到tanδ<1，并且随着频率的增加，所有面团样品的tanδ 都呈现出先迅速减小后缓慢增加的趋势。这可能是由于在面团形成的初期阶段，黑小麦粉中的纤维阻碍了面筋网络结构的形成，导致面团稳定性降低，更容易受到外力的影响而发生流动，因此面团的黏性较小。而在同一扫描频率下，与未添加GOD的面团相比，添加了GOD 的面团其tanδ 值有所降低，并且在GOD 添加量为1.1%时达到最低值。这进一步证明了适量添加GOD 可以增强黑小麦粉面团的黏弹性。
2.5 GOD 对黑小麦粉面团拉伸特性的影响
制作面制品时的成型率由延展度、拉伸比共同决定[21]。如表3 所示，随着GOD 的添加，黑小麦粉面团的拉伸能量、拉伸阻力和拉伸比均呈现出增大的趋势。然而，当GOD 的添加量超过0.8%时，以上指标均出现不同程度的下降。说明过量添加GOD 使黑小麦面团的品质下降[22]。瞿旭[23]研究结果也表明，适量GOD 使面团拉伸阻力提高和延展性降低，面团变得更紧密、硬实。
表3 GOD 对黑小麦粉面团拉伸特性的影响
Table 3 Effect of GOD on tensile properties of black wheat dough
GOD 添加量/% 拉伸能量/(g·mm) 拉伸阻力/g 延展度/mm 拉伸比/(g/mm)0 685.96±67.35a 41.56±4.89b 19.24±0.48ab 2.16±0.30b 0.2 694.20±59.93a 44.89±2.15b 18.16±0.82ab 2.47±0.01ab 0.5 760.25±48.40a 46.26±3.17ab 17.65±1.05b 2.63±0.29ab 0.8 796.32±39.42a 52.75±1.79a 18.04±0.60ab 2.93±0.19a 1.1 758.67±88.32a 47.56±0.17ab 19.26±0.68ab 2.47±0.08ab 1.4 713.98±37.57a 45.07±2.67b 19.77±1.37a 2.29±0.29b
2.6 GOD 对黑小麦粉面团蛋白质二级结构的影响
蛋白质二级结构变化在一定程度上决定了蛋白质的加工性能[11]。根据图 2 所示，与添加0% GOD 的黑小麦粉面团相比，添加了不同量GOD 的面团在红外光谱吸收峰的位置上并没有明显的差异，也没有旧峰消失或新峰产生。此表明添加GOD 并不会改变黑小麦粉面团蛋白质的二级结构。然而，峰的强度却发生了一定的变化，这暗示着GOD 对黑小麦粉面团蛋白质的空间结构产生了一定的影响。α-螺旋为蛋白质中最稳定的二级结构之一，赋予了蛋白质弹性。β-折叠是蛋白中最主要的二级结构，GOD 通过氧化作用促使面筋蛋白分子交联聚集，有利于α-螺旋和β-折叠结构的稳定，同时α-螺旋和β-折叠相对含量的增加赋予面团良好弹性，增强蛋白质结构稳定性。
图2 不同GOD 添加量的黑小麦粉面团红外光谱图
Fig.2 Infrared spectrum of black wheat dough with different amount addition of GOD
图3 显示，当GOD 添加量为0.8%、1.1%、1.4%时，与未添加GOD 相比，β-转角相对含量依次减少了30.28%、28.75%、3.32%，α-螺旋相对含量依次增加了126.08%、124.60%、18.98%，β-折叠相对含量依次增加了 18.78%、17.22%、26.19%，而无规则卷曲相对含量则降为0。α-螺旋与β-折叠为有序结构，β-转角与无规则卷曲为无序结构，面筋蛋白的有序结构需大量氢键维持其构型[24]。当GOD 添加量为0.8%时有序结构高达68.31%，适量添加GOD 使黑小麦粉面团蛋白质氢键增加，有序结构占比增加，蛋白弹性和结构稳定性提高，适量添加GOD 可以增加黑小麦粉面团中蛋白质的氢键数量，从而提高有序结构的占比。这种变化有助于增强蛋白质的弹性和结构稳定性。因此，适量添加GOD 对改善黑小麦粉面团的物理性质具有积极作用，使面团硬度、嚼劲和弹性增加，有利于面团品质的提升。
图3 GOD 对黑小麦粉面团蛋白质二级结构的影响
Fig.3 Effect of GOD on protein secondary structure of black wheat dough
2.7 GOD 对黑小麦粉面团巯基与二硫键的影响
游离巯基与二硫键的含量是评估面筋蛋白交联程度的关键指标。根据图4 可知，在GOD 添加量为0.8%时，游离巯基含量达到最低值，为3.14 μmol/g，与未添加GOD 的对照组（3.83 μmol/g）相比，减少了18.02%。结果表明，添加GOD 可以有效地降低黑小麦粉面团中的游离巯基含量，并相应地增加二硫键的含量，从而促进了面筋蛋白的交联程度，与孔晓雪等[19]研究结论类似。这种变化对于改善面团的物理性质和加工性能具有积极的影响。
图4 GOD 对黑小麦粉面团巯基与二硫键含量的影响
Fig.4 Effect of GOD on the content of sulfhydryl and disulfide bonds in black wheat dough
2.8 GOD 对黑小麦粉面团微观结构的影响
如图5 所示，对于添加量0% GOD 的黑小麦粉面团（图5a），由于其中存在较多阻碍面积网络结构形成的纤维。而使面筋蛋白的微观结构显得相对疏松，且难以形成连续的成片面筋膜。此外，淀粉颗粒与面筋蛋白之间的结合度也较低[15]。由图5b～5d 可知，随着GOD 添加量的增加，面筋结构逐渐变得更加紧密。孔洞数量减少，面筋膜变得连续且均匀。同时，淀粉颗粒和纤维被紧密地包裹在面筋网络结构中[12]。这说明适量的GOD 添加有助于改善面筋的微观结构。由图5e～5f 可知，当GOD 添加量过多时，会导致蛋白质过度交联聚集，使得部分淀粉颗粒被迫暴露在外。此外，过量的GOD 还会产生大量的过氧化氢气体，这会破坏面团的稳定结构，不利于面筋网络结构的整体强度和紧密性。
图5 GOD 对黑小麦粉面团微观结构的影响（2 000 X）
Fig.5 Effect of GOD on microstructure of black wheat dough (2 000 X)
注：图中箭头指示和圈出范围中不规则网状结构为纤维、圆团状为淀粉颗粒。
Note: The arrows and circle in the figure indicate the irregular network structure is fiber, and the round group is starch particles.
综上所述，当GOD 的添加量为0.8%时，黑小麦粉面团的微观结构最为完整和紧密。这表明适量的GOD 添加对于优化面筋的微观结构和提高面团的品质具有积极的作用。
2.9 GOD 对黑小麦粉面团麦谷蛋白、麦醇溶蛋白及麦谷蛋白大聚体的影响
黑小麦粉面团面筋蛋白中麦醇溶蛋白主要负责赋予面筋蛋白延展性[13]，使得面团在受到外力时能够延展而不断裂。而麦谷蛋白则主要贡献于面筋蛋白的弹性，使得面团在受力后能够迅速恢复到原始状态。这两种蛋白的协同作用使得面筋具有良好的加工性能和口感；其中将分子量超过100 kDa 的聚合体称为麦谷蛋白大聚体（Glutenin macropolymer, GMP）[19]，GMP 是具有弹性和刚性的紧密纤维状网络结构，是面制品具有弹性和硬度的原因，且GMP 含量与面团强度、面制品咀嚼性、弹性及硬度呈显著正相关[21]。由表4 可知，GOD 的加入显著降低了麦醇溶蛋白和麦谷蛋白的含量，GMP 含量随GOD 添加量的增加呈先增后减的趋势，这与孔晓雪等[19]研究结果一致。当GOD 添加量为0.8%时，麦醇溶蛋白：麦谷蛋白为0.81，最接近最适比（1.0），因此当GOD 添加量为0.8%时，黑小麦粉面团能形成较好面筋网络结构，具有较好黏弹性。
表4 GOD 对黑小麦粉面团麦谷蛋白、麦醇溶蛋白及麦谷蛋白大聚体的影响
Table 4 Effect of GOD on glutenin, gliadin, and glutenin macropolymer of black wheat dough
GOD 添加量/%麦醇溶蛋白含量/%麦谷蛋白含量/%麦醇溶蛋白：麦谷蛋白麦谷蛋白大聚体含量/%0 3.92±0.01a 5.18±0.42a 0.76±0.01bc 2.71±0.02e 0.2 3.71±0.06b 4.94±0.54b 0.75±0.03c 2.72±0.03de 0.5 3.66±0.03b 4.85±0.69b 0.75±0.02c 2.75±0.01cd 0.8 3.64±0.01b 4.52±0.62c 0.81±0.01a 2.86±0.04a 1.1 3.46±0.01c 4.46±0.27c 0.78±0.01b 2.82±0.01b 1.4 3.39±0.01c 4.38±0.25c 0.77±0.01b 2.77±0.06c
3 结论
本研究发现，GOD 能有效促进黑小麦粉面团中二硫键的交联，显著改善其理化特性。适量添加GOD 能显著降低黑小麦粉面团中游离巯基的含量，同时增加二硫键的含量，从而加深蛋白质的交联程度。这种变化使得面筋网络的孔洞减少，淀粉颗粒与纤维被更紧密地包裹在面筋网络结构中，进一步完善了面筋蛋白的网络结构。然而，值得注意的是，GOD 的加入会降低黑小麦粉面团的延伸性。此外，当GOD 添加量过多时，会导致蛋白质过度交联聚集，使得部分淀粉颗粒暴露在外，进而使得面团的综合黏弹性和稳定性开始下降。
因此，对于黑小麦粉面团来说，控制GOD 的添加量至关重要。本研究表明，当GOD 的添加量为0.8%时，其对黑小麦粉面团理化特性的改善效果最为显著。这一发现为开发黑小麦食品、提高其食用品质提供了重要参考，同时为后续研究GOD 对黑小麦面团品质的影响提供了指导。未来，我们还可以进一步探索黑小麦健康功能食品的开发以及黑小麦食品品质的改良。
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