大豆是我国重要的粮食、油料和经济作物。截止2020年，我国大豆总产量约在1 960万 t，而进口转基因高油大豆约占我国大豆总产量的83%[1]。高油大豆是根据GB1352—2009《大豆》中粗脂肪干基料含量在20%以上的大豆，主要用途是榨油。这是由于近年来我国国民膳食结构发生了变化，其中对食用油和肉类的消费量持续增加[2]。因此进口大豆的储备数量大幅上升，我国大豆储备规模随之日趋增大[3-4]。
通常大豆的储藏时间长短和温度具有高度的关联性，而温度是引起霉菌生长的直接原因[5]。“房式仓”为我国仿造建造的机械化房式仓，多为砖木结构，但设计低矮通风条件差，极易发生不安全储粮因素[6]。“房式仓”由于其自身仓型特点，会使得粮堆部分点位存在高温高湿的不安全储粮因素。同时大豆由于其自身籽粒结构特点以及所富含的蛋白质和脂肪，极易吸湿发热造成霉变，进而导致浸油赤变、发芽力丧失等不良现象。目前大部分的研究[7-10]都以普通大豆为对象，而对高油大豆在储藏过程中的真菌群落变化鲜有报道。高通量测序技术可以直接对样本DNA进行提取测序，从而得到样品中全面的病原微生物信息，且能检测到表达丰度较低的基因，降低漏检率。
因此本研究采用高通量测序技术对房式仓中高油大豆储藏期间真菌群落进行动态监测，从而针对储藏期间真菌变化规律建立一套科学的储藏体系，为保证大豆的安全储藏和品质控制提供有力措施。实验选用进口阿根廷高油大豆，采用房式仓对夏季入仓的进口大豆进行常规储藏，通过对粮情、大豆水分及其真菌多样性的动态监测探究粮情发生危险时的真菌群落特征和变化规律。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验采用中储粮某直属库2022年进口阿根廷高油大豆，按照表1中条件各取粮堆中混合样品150 g，称取50 g于无菌均质袋中作为3个平行样品，命名为“样品名_a、b、c”于实验室中4 ℃保存；采用粮情监测系统ASDL-128型和测温电缆传感器型号18B20对取样条件进行监测。
表1 取样条件及样品命名
Table 1 Sampling conditions and sample naming
取样时间 2022-06-172022-08-10 2022-09-15储藏温度/℃24.2 30.7 27.2样品命名 A47 B47 C47
1.2 仪器与设备
电子天平TX223L：日本岛津公司；恒温恒湿箱HWS-300：宁波东南仪器有限公司；粮情监测系统ASDL-128型：赤峰今辰电子有限公司；测温电缆传感器型号18B20：辽宁省宽甸市桐源电缆厂；TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit：Illumina公司。
1.3 实验方法
1.3.1 水分含量的测定
水分含量按照GB/T 20264—2006《粮食、油料水分两次烘干测定法》测定。
1.3.2 微生物宏基因组ITS 1区测序
采用Illumina平台对群落DNA片段进行双端（Paired-end）测序，利用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库[11]，测序原始数据以FASTQ格式保存。
1.4 数据处理
采用DADA2和Vsearch两种方法进行序列去噪、聚类，使用R语言脚本，对全部样本中所包含的高质量序列的长度分布进行统计。选用UNITE数据库（Release 8.0，https://unite.ut.ee/）[12]对样本真菌ITS序列进行物种注释。使用“qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree”的分析流程，调用mafft[13]进行多序列对齐，并mask无系统发育信息的部分，再调用FastTree 构建了系统发育树，生成无根树文件；最后以中心点基础构建有根树文件。
2 结果与分析
2.1 房式仓中高油大豆水分含量的变化
水分是粮食内部各种生理生化反应的媒介物，其含量的多少决定了粮食储藏过程中品质的变化速率以及储藏稳定性[14]。如图1，进口高油大豆的水分含量随着储藏时间的延长而略有升高，由入仓水分9.5%升高至9.85%。由于房式仓的仓型特点和夏季入仓的气候特点，仓储企业在入仓前将大豆水分控制在10%以下来降低粮情风险。当大豆吸湿而水分升高时，籽粒呼吸释放出的一部分水汽被大豆吸收[15]，释放出来的热能则聚集在豆堆内不易散发出来，有可能导致大豆热损[16-17]。
图1 大豆水分含量变化
Fig.1 The changes of moisture in soybeans
2.2 高油大豆中真菌的分类学注释分析
物种的注释过程，其本质是与参考序列数据库进行比对，以及对比结果进行打分判定的过程。由图2中可知，不同储藏时期的大豆样品真菌群落共计属于4个门，9个纲，14个目15个科，21个属，19个种。随着储藏的进行，在各个分类水平下的OTU数目逐渐增加，真菌数量在逐渐增加。
图2 大豆的分类学注释结果统计图
Fig.2 Statistical chart of high oil soybean in annotation taxonomy
2.3 大豆中真菌群落多样性指数性分析
为了能够较为全面的评估样品中真菌菌群的Alpha多样性，本实验以Chao1和Observed species指数表征样品真菌菌群丰富度，以Shannon和Simpson指数表征多样性，以Pielou’s evenness指数表征均匀度，以Good’s coverage指数表征覆盖度。Chao1，Simpson指数，Observed species指数在三份样品中均呈逐渐上升趋势，说明随着储藏的进行，大豆的真菌群落多样性逐渐升高。Pielou’s evenness指数在C47样品中显著高于A47，47样品，说明随着储藏时间的延长，真菌菌群均匀度和多样性显著升高，大豆样品的真菌群落从种类到数量开始大量繁殖（图3）。
图3 多样性指数箱线图
Fig.3 The diversity index box plots of samples
2.4 大豆中真菌在不同分类水平下的组成差异分析
如图4，大豆在不同储藏时期的真菌群落在门的水平上分类为4个菌门，分别为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、羊肚菌门（Mortierellomyco）、毛霉菌门（Mucoromycota）。其中毛霉菌门大多为腐生菌，这种菌因能立即用大多数简单的碳水化合物，将比较复杂的物质留给其他微生物去利用，所以有“糖菌”之称。子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）随着储藏时间的延长其数量呈现增加趋势直至成为优势菌门，而羊肚菌门（Mortierellomyco）在B47样品中数量降低为0，毛霉菌门（Mucoromycota）在C47样品中数量降低为0。
图4 在门（4a）、种（4b）的水平下的组成差异
Fig.4 Composition differences at the level of the phylum (6a) and genus (6b)
房式仓中储藏的转基因高油大豆在不同储藏时期的真菌群落在种的水平上进行分类统计，如图7，选取相对丰度较高的10个物种绘制成表，相对丰度是指为该分组方案各样本中对应物种的相对丰度，如表2。10个菌种在数量上均呈现随着储藏时间的延长而有不同程度的增加趋势（C47＞B47＞A47）。其中Saitozyma_podzolica为一种新型的非常规产油酵母，可以利用多种碳源（醋酸盐或木质纤维素）生成单细胞油（Single cell oil, SCO），SCO被认为是生物柴油和油脂化学品的可持续来源[18]。该种新型菌株在大豆储藏过程中利用分子生物学技术首次被监测到。Mycosphaerella tassiana为大麦叶烧病菌，属于我国检疫性病原真菌。此前胡佳续等[19]在对美国进口大豆的病原真菌。检测中通过分离培养的方式对该种病原菌进行了分离。真菌群落中的第二优势菌种为Aspergillus_ ruber赤曲霉，赤霉菌属，为进口农产品中常见有害真菌。
表2 各优势菌种在样品中所占丰度
Table 2 Abundances of dominant species among samples
菌种名称 A47 B47 C47 Saitozyma_podzolica 0 0 0.002 084 88 Mycosphaerella_tassiana 0 0.000 003 9 0.000 951 79 Aspergillus_ruber 0.000 004 5 0.000 008 6 0.000 423 02 Didymella_exigua 0 0.000 117 41 0.000 362 59 Aspergillus_penicillioides 0 0 0.000 453 23 Septoria_cretae 0 0 0.000 317 26 Robbauera_albescens 0 0 0.000 271 94 Papiliotrema_aurea 0 0 0.000 241 72 Trichosporon_dohaense 0 0 0.000 211 51 Plectosphaerella_oratosquillae 0 0 0.000 196 4
2.5 转基因高油大豆真菌的物种组成及丰度热图
热图是使用R脚本计算各样本以及各分类单元的聚类结果，展示各个样本的物种丰度分布趋势，一般采用平均丰度前20位的进行绘制，如图5。在房式仓中储藏的转基因高油大豆中，随着储藏时间的延长，只有Thermomyces嗜热真菌在数量上呈现先增加后降低的趋势，其它19个菌属的数量均随着储藏时间的延长而减少。
图5 大豆中真菌物种组成热图
Fig.5 The heatmap of the fungi communities in high oil soybean
2.6 不同储藏时期大豆真菌群落差异分析
通过Ven图进行群落分析，如图6，对房式仓中三个储藏时期的样品进行两两比对发现，三个时期共有的OTU数目最多的两组分别是第二和第三储藏期(B47、C47)，共有的OTU数量为19个。而对三个储藏期的样品进行共同比对发现，三者共有的OTU数量仅为8个。而三者特有的OTU数量有所增长，C47特有的OTU数量为64个。这说明随着储藏时间的延长，房式仓中的转基因大豆中真菌的菌群丰富度和多样性在增加。
图6 不同储藏期大豆物种差异性比较Ven图
Fig.6 The Ven Plot of the samples
注：不同样本分组用不同的颜色表示，不同颜色圆圈重叠的区域标注数字表示共有的OTU数。
Note: Different sample groups are represented by different colors, and the area with overlapping circles of different colors indicates the number of OTU in common.
2.7 Beta多样性分析
依据Ramette[20]的方法对房式仓中储藏的进口高油大豆进行PCA分析（Principal Component Analysis）。如图7，图中的点分别代表了不同储藏时期大豆中的真菌群落结构，各个点距离越近表示群落结构的相似度越高。可以看出，A47构具有较高的相似度，而到了第三储藏期C47与前两者真菌群落结构差异较大，说明到了第三储藏期大豆中的真菌群落不仅多样性显著增加，真菌群落结构也发生了明显演替。
图7 不同储藏时期的大豆中真菌的主成分分析图
Fig.7 Principal component analysis of mould in soybean among different storage periods
3 结论
影响大豆储存品质的因素主要有储存水分、温度和微生物，这些因素之间相互关联、相互作用，构成一个复杂的大豆储存生态体系，共同影响大豆储藏质量变化，理清这些因素之间的关系，一直是大豆储藏安全方面研究的一个难点。而“房式仓”由于其特殊建筑结构会使得储藏粮堆存在风险点。因此本研究通过监测夏季入“房式仓”的进口转基因高油大豆的品质变化及真菌群落结构变化，来探究储藏方式对转基因大豆的储藏质量的影响。
通过跟踪储藏期6月至9月的大豆样品水分含量发现进口高油大豆的水分含量由入仓水分9.5%升高至9.85%。水分变化不明显的原因在于降低了大豆入仓前的水分，对于大豆而言，当其含水量超过临界水分时，呼吸增强所产生的水分及热量将会严重威胁其储藏安全[30]。利用Illumina平台对9份大豆样品的DNA片段进行双端测序，对OTU进行物种分类后发现，不同储藏时期的大豆样品中的真菌群落共计属于4个门，9个纲，14个目，15个科，21个属，19个种。随着储藏时间的延长，大豆的真菌菌群均匀度和多样性呈现显著升高的趋势。大豆在不同储藏时期的4个优势菌门为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、羊肚菌门（Mortierellomyco）、毛霉菌门（Mucoromycota）。在种的水平上进行分类统计分析发现相对丰度较高的10个菌种在数量上均呈现随着储藏时间的延长而有不同程度的增加趋势（C47＞B47＞A47），并发现1种有害真菌赤霉菌。通过Ven 图分析和Beta 多样性分析发现，在房式仓中储藏的前两个储藏期的大豆样品中真菌群落结构具有较高的相似度，而到了第三储藏期与前两者真菌群落结构差异较大，说明到了第三储藏期大豆中的真菌群落不仅多样性显著增加，真菌群落结构也发生了明显演替。
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备注：本文的彩色图表可从本刊官网（http//lyspkj.ijournal.cn）、中国知网、万方、维普、超星等数据库下载获取。