咖啡中绿原酸是奎宁酸和羟基肉桂酸之间形成的一大类酯，含量较为丰富，约占咖啡质量的6%～12%[1]，它们以位置异构体和几何异构体的复杂混合物形式存在于咖啡中，其中咖啡酰奎宁酸（caffeoylquinic acid，CQA）最丰富，其次是阿魏酰奎宁酸类（FQA）、二咖啡酰奎宁酸（diCQA）和对香豆素酰奎尼酸类（p-CoQAs）[2]。咖啡绿原酸不仅具有抗氧化、抗菌、保护心脏和神经、调控糖脂代谢和抗肿瘤等生物活性，还是一种新型、天然的食品污染物抑制剂和免疫增强剂[3-5]，也是咖啡苦味物质的来源之一[6]。
烘焙条件对咖啡豆化学性质有较大影响，其中绿原酸在烘焙过程中发生酰基迁移、脱水、差向异构化，或与醋酸、奎宁酸和莽草酸的酯交换，通过4 种不同的反应途径产生热降解，目前咖啡豆中共鉴别出137 种不同的绿原酸衍生物[7-8]。随着烘焙程度增加，绿原酸内酯的形成改变了异构体间的含量比例[9-10]，进一步绿原酸内酯的碳-碳键断裂，形成咖啡酸、奎宁酸、奎宁内酯类，逐步形成挥发性风味成分，如呋喃、吡啶、吡咯和吡嗪等[11]。MOON 等[11]指出绿原酸总量随着烘焙程度的增加而降低；轻度烘焙时，新绿原酸和隐绿原酸含量较生豆有所上升[12]，主要原因是绿原酸发生了异构体的转化；异绿原酸类在烘焙过程中同样发生转化，并形成相应内酯[13]，但未见其转化深入研究。除咖啡酰奎宁酸类、二咖啡酰奎宁酸（主要成分是异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C），阿魏酰奎宁酸类也是咖啡中含量较高的一类绿原酸。ADRIANA 等[14]将中粒种咖啡生豆去咖啡因的水浸出物烘干后压缩成胶囊，测定其成分发现 5-阿魏酰奎宁酸含量为（22.1± 0.02）µmol/0.4 g，含量高于异绿原酸类；CLIFFORD 等[15]报道罗布斯塔生豆中5-阿魏酰奎宁酸含量为1.11%。此外，咖啡中绿原酸的检测方法，主要有液相色谱法[16]、液相色谱-质谱-质谱法[17]等。胡皓等建立的分析方法完成了绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 等6 种绿原酸定量分析，并发现咖啡豆中绿原酸含量最高，占6 种绿原酸类化合物总量的76.1%[18]。笔者在前期的工作中，发现咖啡生豆和烘焙豆中富含5-阿魏酰奎宁酸，但咖啡中5-阿魏酰奎宁酸的检测方法、含量及其在烘焙过程中的变化规律均未见报道。
因此，本研究采用液相色谱仪，建立咖啡中7 种绿原酸类化合物含量的定量分析方法，并分析不同烘焙程度下，绿原酸异构体间的动态转化关系及含量变化，旨在为咖啡烘焙及其品质控制提供基础数据。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
乙酸（分析纯）：四川西陇科学有限公司；磷酸（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）：J.T.Baker。
绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C（1000 µg/mL）：天津阿尔塔科技有限公司；5-阿魏酰奎宁酸（纯度≥98%）：上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
LC-20A 高效液相色谱仪：日本岛津公司；AL204 万分之一电子天平：瑞士梅特勒托利多公司；DISCV-IV-60 纯水系统：云南福瑞达进口有限公司；BRZ2 咖啡烘焙机、Colorette 3b 专业咖啡颜色测定仪、VTA6S3 专业咖啡研磨仪：德国PROBAT 仪器公司。
1.3 标准溶液配制
准确称取5-阿魏酰奎宁酸5 mg 用甲醇溶液定容于5 mL 容量瓶中，质量浓度为1 mg/mL；分别取质量浓度为1000 µg/mL 隐绿原酸、新绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 的标准溶液各50 µL，绿原酸150 µL，5-阿魏酰奎宁酸100 µL 用甲醇定容至1 mL，得到隐绿原酸、新绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C浓度为50 mg/L、5-阿魏酰奎宁酸浓度为100 mg/L、绿原酸浓度为150 mg/L 的标准使用液，并再次逐级稀释配制成2、5、10、20、40、50 mg/L 及5-阿魏酰奎宁酸对应2 倍和绿原酸对应3 倍浓度的校准曲线系列溶液。
1.4 咖啡样品的准备
10 支咖啡豆由项目组成员联系生产厂家购买，并经专业的咖啡师剔除瑕疵豆后作为实验样品，10 支咖啡豆的信息详见表1。
表1 10 支咖啡豆的信息
Table 1 The information of 10 coffee beans
编号 产地 编号 产地1# 普洱孟连县 6# 临沧镇康县2# 普洱思茅区 7# 大理宾川县3# 保山隆阳区 8# 肯尼亚尼耶里产区4# 保山隆阳区 9# 哥伦比亚惠兰产区5# 德宏芒市 10# 巴拿马波奎特
1.5 样品前处理
将实验豆粉碎至全部通过60 目的样品筛，准确称取样品0.2～0.3 g（精确至0.1 mg）于100 mL比色管中，加入100 mL 0.1%磷酸溶液，沸水浴中加热30 min，冷却后用0.1%磷酸溶液定容至100 mL，用0.45 µm 水系膜过滤后，按照1.5 的色谱条件进行色谱分析。
1.6 色谱条件
色谱柱：Aglient ZORBAX ODS-C18（150 mm×4.6 mm, 5 µm）；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：330 nm；进样量为：10 µL；流动相A：0.5%乙酸水溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱见表2。
表2 梯度洗脱表
Table 2 The table of gradient elution
时间/min流速/(mL/min)A 流动相/% B 流动相/%0 1.00 95 5 20 1.00 85 15 22 1.00 75 25 25 1.00 85 15 35 1.00 75 25 40 1.00 95 5
1.7 咖啡豆样品的烘焙
10 支咖啡豆经专业的烘焙师按图1 的烘焙曲线得到浅烘、中烘、深烘等3 个程度的烘焙豆，烘焙好的咖啡豆经研磨仪研磨后，平行测定3 次色值，取平均值为色值结果。
图1 烘焙曲线
Fig.1 Roasting curve
烘焙曲线：将100 g 生咖啡豆放入烘焙机中，设置烘焙曲线：入豆温度160 ℃，2 min 时达回温点130 ℃，转黄时间6 min；转黄温度150 ℃；转棕时间7.5 min；转棕温度：180 ℃；刚进入一爆出豆为浅烘，时间为 8～8.5 min，出豆温度185 ℃，一爆结束时出豆为中烘，时间9～9.5 min，出豆温度190 ℃，二爆密集时出豆为深烘，时间10～10.5 min，出豆温度200 ℃，色值范围（浅焙：155～176；中烘：94～120；深烘：64～71），烘焙曲线详见图1。
1.8 单因素实验
以绿原酸的提取率作为响应值，对磷酸溶液的体积分数（0.025%、0.05%、0.1%、0.125%、0.15%），液料比（300∶1、400∶1、500∶1、600∶1、700∶1）（mL∶g）及提取时间（20、30、40、45 min）3 个重要因素进行考察。
1.9 数据处理
采用Design Expert 12 和ORIGINPRO 统计软件对样品前处理的方法进行单因素实验和响应面分析，采用ORIGINPRO 进行单因素方差分析，P＜0.05 表示含量变化显著。
2 结果与分析
2.1 样品前处理方法的优化
2.1.1 单因素实验结果
当磷酸的体积分数为0.025%～0.1%时，绿原酸的提取量随着磷酸体积分数的增大而增大，当磷酸体积分数继续增大时，提取量反而下降，主要是绿原酸本身是一种有机酸，酸性条件有利于绿原酸的提取，而酸性太强会造成绿原酸的酸解。随着液料比及提取时间的增大，提取量均随之上升，当液料比达到500∶1 时绿原酸提取量开始下降，可能是提取溶剂体积增加，杂质溶出，干扰了绿原酸的提取；水浴提取时间≥30 min 时，提取率趋于稳定，因此选择磷酸体积分数为0.1%，液料比为500∶1，提取时间为30 min，详见图2。
图2 单因素实验结果
Fig.2 Results of single factor experiment
2.1.2 Box-Behnken 响应面优化实验
在单因素实验的基础上，以磷酸体积分数（X1）、液料比（X2）和提取时间（X3）为考察因素，根据Box-Behnken 响应面法进行三因素三水平的实验设计，以绿原酸的提取率(Y)为响应值，进行响应面分析。实验设计及结果见表3。应用Design-Expert 12 对数据进行多元线性回归和二项式拟合，得到回归方程为：
表3 Box-Behnken 实验因素、水平及结果
Table 3 Factors, levels and results of Box-Behnken experiments
序号 磷酸体积分数/%液料比/(mL∶g)提取时间/min绿原酸含量/(mg/g) 序号 磷酸体积分数/%液料比/(mL∶g)提取时间/min绿原酸含量/(mg/g)1 0.0875 300 20 26.4 10 0.0875 450 32.5 38.3 2 0.0250 450 45 29.1 11 0.1500 450 20 31.2 3 0.0875 450 32.5 38.1 12 0.0875 450 32.5 38.4 4 0.0875 450 32.5 37.8 13 0.0250 300 32.5 25.0 5 0.0875 600 20 29.2 14 0.1500 300 32.5 30.1 6 0.0875 300 45 27.6 15 0.0250 600 32.5 27.8 7 0.0250 450 20 25.5 16 0.1500 600 32.5 31.0 8 0.0875 450 32.5 38.4 17 0.1500 450 45 30.2 9 0.0875 600 45 28.6
Y=38.20+1.89X1+0.937 5X2+0.4X3-0.475X1X2-1.15X1X3-0.45X2X3-4.34X21-5.39X22-4.86X23
对回归模型进行方差分析，P＜0.000 1，F=283.37，表明回归模型具有高度显著性。同时，失拟项P=0.106 4＞0.05，无显著性，说明响应值与预测值之间有较好的拟合度和可信度。利用ORIGIN 软件绘制各因素交互作用的响应面图，响应曲面坡度越大，表明该因素对响应值的影响越大。如图3 所示，各因素对响应值影响的大小顺序为磷酸体积分数＞液料比＞提取时间。
图3 各因素交互作用的响应面图
Fig.3 Response surface plot of interaction of various factors
2.1.3 模型验证
通过对回归方程求解，得到最佳提取条件如下：磷酸体积分数为0.105%，液料比为463.853（mL∶g），提取时间为32.812 min，预测的响应值为38.419 mg/g。为方便实际操作，将上述条件调整为磷酸体积分数0.1%，液料比500∶1，提取时间30 min。在该条件下，进行3 次平行实验验证模型的可靠性。结果表明，平均提取率为38.35 mg/g，预测值相差0.18%，较为接近。表明优化后的提取条件是可靠的。
2.2 色谱条件的选择
主要比较了磷酸-甲醇、乙酸-乙腈流动相的分离效果。异绿原酸B 和异绿原酸A 结构相近，采用乙酸-乙腈作为流动相的分离度优于磷酸-甲醇溶液，故采用乙酸-乙腈作为流动相。结果显示，7 种绿原酸化合物分离度良好，咖啡生豆和烘焙豆中无杂质干扰目标物的测定。混合标准溶液（绿原酸含量150 mg/L）和中烘样品色谱图见图4。
图4 混合标准溶液（绿原酸含量150 mg/L）（A）和中烘样品（B）HPLC 图
Fig.4 HPLC Diagram of mixed standard solution(chlorogenic acid 150mg/L) (A) and medium baked sample (B)
1. 新绿原酸；2. 绿原酸；3. 隐绿原酸；4. 5-阿魏酰奎宁酸；5. 异绿原酸B；6. 异绿原酸A；7. 异绿原酸C
1. Neochlorogenic acid; 2. Chlorogenic acid; 3. Cryptochlorogenic acid; 4. 5-O-ferulatequinic acid; 5. Isochlorogenic acid B; 6. isochlorogenic acid A; 7. Isochlorogenic acid C
2.3 方法的线性范围和检出限
对方法的线性范围、检出限进行考察，7 种绿原酸化合物的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限详见表4。7 种绿原酸化合物在2～150 mg/L 范围内具有良好的线性关系，用3 倍信噪比、10 倍信噪比计算方法的检出限和定量限，方法检出限0.005～0.5 mg/g，定量限0.02～2 mg/g，能够满足咖啡中7 种绿原酸化合物定量分析的要求。
表4 7 种绿原酸化合物的线性范围、线性方程、检出限和定量限
Table 4 Linear range, linear equation, detection limit and quantification of 7 chlorogenic acid compounds
名称 线性方程 线性范围/(mg/L)相关系数 检出限/(mg/g) 定量限/(mg/g)绿原酸 Y=31 246.8X-22 679.8 6～150 0.999 9 0.005 0.02隐绿原酸 Y=30 476.2X-8 919.14 2～50 0.999 9 0.01 0.04新绿原酸 Y=30 064.5X-5 629.82 2～50 0.999 99 0.01 0.04异绿原酸B Y=36 879.7X-13 883 2～50 0.999 4 0.05 0.2异绿原酸A Y=42 059.5X-18 732.5 2～50 0.999 7 0.1 0.4异绿原酸C Y=40 065X-33 140.3 2～50 0.999 95 0.1 0.4 5-阿魏酰奎宁酸 Y=3 065.8X-2 093.4 4～100 0.999 99 0.5 2
表5 方法的回收率及精密度
Table5 Recovery and precision of the method
注：MEAN 表示平均回收率，RSD 表示相对标准偏差。
Note: MEAN represents average recovery rate, RSD represents relative standard deviation.
卡蒂姆生豆加标水平 深烘咖啡豆加标水平名称 加标量/(mg/g)Mean/%RSD/%加标量/(mg/g)Mean/%RSD/%加标量/(mg/g)Mean/%RSD/%加标量/(mg/g)Mean/%RSD/%绿原酸 0.3 90.8 4.7 0.9 91.43.8 0.3 88.3 4.4 0.9 93.5 3.4隐绿原酸 0.1 103.0 3.4 0.3 98.73.2 0.1 92.5 3.8 0.3 92.9 3.7新绿原酸 0.1 94.7 2.7 0.3 96.43.5 0.1 90.6 3.5 0.3 92.8 4.6异绿原酸B 0.1 88.5 3.9 0.3 102.54.6 0.1 87.3 3.6 0.3 96.4 3.7异绿原酸A 0.1 87.8 4.2 0.3 90.33.1 0.1 88.4 4.5 0.3 89.6 2.9异绿原酸C 0.1 90.9 4.8 0.3 91.42.9 0.1 88.0 4.8 0.3 94.3 4.3 5-阿魏酰奎宁酸 0.2 91.8 2.8 0.6 94.73.0 0.2 86.2 3.3 0.6 93.8 5.1
2.4 回收率及精密度
实验选取卡蒂姆生豆、深烘咖啡豆为样品，分别添加1.3 的标准使用液（其中隐绿原酸、新绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C浓度为50 mg/L、5-阿魏酰奎宁酸浓度为100 mg/L、绿原酸浓度为150 mg/L 的标准使用液）500 µL、1 500 µL，按1.5 完成试样前处理后，按1.6 的仪器条件进行测定。每个添加水平平行测定6 次，计算7 种绿原酸化合物的平均回收率和相对标准偏差，以考察方法的准确度和精确度，在0.1～0.3 mg/g、0.3～0.9 mg/g 两个水平进行加标回收实验，方法的精密度和回收率详见表 5。方法的回收率范围86.2%～103.0%；相对标准偏差2.7%～5.1%；达到GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》的要求，可以用于咖啡中7 种绿原酸化合物的定量分析。
2.5 不同产区咖啡生豆中绿原酸含量的比较
对10 支不同产地的咖啡生豆完成了7 种绿原酸化合物含量测定，其中7 种绿原酸化合物的总量范围 85.8～105.3 mg/g，最高的是德宏咖啡105.3 mg/g，其次是为大理咖啡102.6 mg/g；绿原酸范围38.6～59.7 mg/g，其中含量最高的是巴拿马咖啡59.7 mg/g，其次是德宏咖啡55.0 mg/g，绿原酸的含量占7 种绿原酸化合物总量的42.9%～60.7%；5-阿魏酰奎宁酸含量25.4～38.9 mg/g，含量最高的是大理咖啡38.9 mg/g，其次是德宏咖啡35.6 mg/g，占7 种绿原酸化合物总量的25.8%～38.3%。新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 的含量分别为2.2～3.8 mg/g、4.3～5.7 mg/g、1.6～5.7 mg/g、0.7～1.7 mg/g、1.2～3.0 mg/g。
咖啡生豆中绿原酸含量最高，其次是5-阿魏酰奎宁酸，咖啡生豆中7 种绿原酸类化合物总量占生豆质量的8.6%～10.5%，与ARIANA[1]报道结果一致；其次是5-阿魏酰奎宁酸，咖啡生豆中5-阿魏酰奎宁酸含量占生豆质量的2.5%～3.9%，结果与CLIFFORD AND JARVIS[15]研究结果相比较偏高，主要原因可能是本课题采用咖啡品种是卡蒂姆，而CLIFFORD AND JARVIS 的研究咖啡品种是罗布斯塔。关于产地对7 种绿原酸的含量影响，本课题未发现显著规律，有待深入研究。
2.6 烘焙过程中绿原酸异构体含量变化
2.6.1 绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸含量的变化
不同烘焙度绿原酸异构体的含量及与生豆中含量的变化结果详见表6。绿原酸在烘焙过程中，随着烘焙程度增加，7 种绿原酸化合物总量、绿原酸的含量显著降低（P＜0.05）；隐绿原酸和新绿原酸在浅烘时，由于绿原酸的异构化，先异构为隐绿原酸，然后经分子内酰基迁移生成新绿原酸[12]，导致隐绿原酸和新绿原酸浅烘时升高到生豆含量的146%～237%和185%～384%，中烘为生豆中含量的98%～154%和124%～247%，深烘时，隐绿原酸和新绿原酸含量显著降低，是生豆含量的51%～72%和41%～116%；该结果与刘兴勇等[19]的研究成果一致。
表6 烘焙咖啡绿原酸异构体含量变化
Table 6 Changes of chlorogenic acid isomers in roasted coffee
烘焙程度绿原酸 生豆 浅烘 绿原酸含量/(mg/g) 38.6～59.7 18.0～25.9 绿原酸剩余量与生豆中总量占比/% / 37～52 隐绿原酸含量/(mg/g) 4.3～5.7 8.7～11.1 隐绿原酸剩余量与生豆中总量占比/% / 146～237 新绿原酸含量/(mg/g) 2.2～3.8 6.3～8.6 新绿原酸剩余量与生豆中总量占比/% / 185～384 异绿原酸B 含量/(mg/g) 0.7～1.7 0.7～1.3 异绿原酸B 剩余量与生豆中总量占比/% / 59～100 异绿原酸A 含量/(mg/g) 1.6～5.7 0.5～1.0 异绿原酸A 剩余量与生豆中总量占比/% / 19～26 异绿原酸C 含量/(mg/g) 1.2～3.0 1.3～2.1 异绿原酸C 剩余量与生豆中总量占比/% / 60～100 5-阿魏酰奎宁酸含量/(mg/g) 24.3～38.9 17.5～25.6 5-阿魏酰奎宁酸剩余量与生豆中总量占比/% / 63～72 绿原酸总量/(mg/g) 85.8～105.3 60.6～68.4 绿原酸总量剩余量与生豆中总量占比/% / 63～77 中烘 深烘10.1～15.2 3.9～6.8 21～31 8～11 5.6～7.4 2.6～3.8 98～154 51～72 4.2～5.8 0.9～3.2 124～247 41～116 0.5～0.8 0～0.3 30～58 0～30 0.4～0.8 0～0.3 7～21 0～11 1.0～1.3 0～1.0 37～72 0～56 14.2～19.0 10.4～12.3 45～58 31～44 39.1～47.7 18.8～26.5 39～53 21～27
2.6.2 异绿原酸A、异绿原酸B 和异绿原酸C 含量的变化
异绿原酸A、异绿原酸B 和异绿原酸C 在浅烘、中烘、深烘的过程中，异绿原酸A 下降得最快，浅烘下降为生豆含量的19%～26%，中烘为7%～21%，深烘下降到0.5 mg/g 以下；异绿原酸B和异绿原酸 C 浅烘下降为生豆含量的 59%～100%，中烘为30%～72%，深烘下降到1 mg/g 以下；笔者比较了异绿原酸A、异绿原酸B 和异绿原酸C 在结构上的差异，7 种绿原酸化合物的结构详见图5，从图中可知，异绿原酸B 和异绿原酸C 比异绿原酸A 在结构上多了一个酯键与O 共轭体系，所以推测三者热降解速度的差异可能与其共轭体系有关，也不排除其热降解为其他的化合物。
图5 7 种绿原酸化合物的结构图
Fig.5 Structural diagrams of 7 chlorogenic acid compounds
2.6.3 5-阿魏酰奎宁酸含量的变化
绿原酸、5-阿魏酰奎宁酸在浅烘、中烘、深烘时的热降解与其余六种绿原酸相比，比例较为稳定，咖啡生豆中三个烘焙度绿原酸含量与生豆中绿原酸的比值分别为：37%～52%、21%～31%、8%～11%；咖啡生豆中三个烘焙度5-阿魏酰奎宁酸的含量与生豆中绿原酸的比值分别为63%～72%、45%～58%、31%～44%。笔者认为，烘焙豆中绿原酸、5-阿魏酰奎宁酸含量与生豆中绿原酸、5-阿魏酰奎宁酸比值可以作为一个“参考值”，用于评价烘焙师的水平和咖啡烘焙程度的内控化学指标。此外，烘焙过程中绿原酸异构体含量的变化与产地无直接关系。
3 结论
本研究建立了一种同时测定咖啡中7 种绿原酸化合物的分析方法，采用100 mL 0.1%磷酸溶液水浴提取30 min，定容过滤后测定，经考察，方法的线性范围、回收率及检出限等满足定量分析要求。同时，采用建立的分析方法测定了10 支不同产地的卡蒂姆咖啡在不同烘焙程度下7 种绿原酸化合物含量的变化；结果表明，随着烘焙程度增加，绿原酸和5-阿魏酰奎宁酸含量显著降低（P＜0.05）；新绿原酸和隐绿原酸的含量先升高再降低；异绿原酸A 的热降解速度明显高于异绿原酸B 和异绿原酸C；5-阿魏酰奎宁酸随着烘焙度增加，含量逐渐降低，与其余5 种绿原酸相比较，绿原酸、5-阿魏酰奎宁酸热降解速度较为稳定，均可作为咖啡烘焙程度的“参考物”，用于评价烘焙师的水平和咖啡烘焙程度的内控化学指标。本论文通过对不同烘焙程度下7 种绿原酸化合物含量变化的研究，可以进一步针对咖啡绿原酸中功效成分进行评价，为咖啡烘焙和品质控制提供参考依据。
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