近年来，我国乳糜泻发病率不断上升。数据表明内蒙古、山东、陕西、浙江等地，易感基因携带人群已超过0.5%[1]。鉴于我国人口基数较大，乳糜泻患者绝对数量不容小觑。终身严格遵守无麸质饮食，是避免因摄入麸质而引起的肠道不适，改善乳糜泻患者生活质量的重要治疗手段。由于无麸质谷物面团中无法形成连续的蛋白质相，构建起的网络结构不够充分，造成面团筋力不足，限制了无麸质谷物产品的开发。有研究发现，以玉米醇溶蛋白（zein）、淀粉和沙蒿胶为原料，添加一定量的乳酸，能够制备出蛋白网络结构连贯、流变特性良好的无麸质面团[2]。提升了所制备面条的蒸煮品质，同时还会影响到面团中zein 的相对分子质量与分子结构[3]。在先前的研究基础上，进一步探讨揉混时间作为乳酸调控下zein 模拟面团加工品质的影响，对比了面团形成时与揉混12 min 后，乳酸酸化面团中水分组成，蛋白质微观结构、相对分子质量、表面疏水性强度，围绕zein 的变化情况，分析了面团的弱化原因。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
乳酸（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；玉米醇溶蛋白：Sigma-Aldrich 公司；沙蒿胶：上海源叶生物科技有限公司；玉米淀粉：黑龙江鹏程生化有限公司（直链淀粉含量 26.14% ±1.64%，支链淀粉含量73.86% ± 1.47%）；溴酚蓝（优级纯）：北京索莱宝科技有限公司；溴化钾（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；考马斯亮蓝G-250：Sigma-Aldrich 公司；实验用水为蒸馏水。
1.2 仪器与设备
DT2000 电子天平：常熟市嘉衡天平仪器有限公司；混合实验仪Mixolab-2：法国Chopin 技术公司；低场核磁共振成像NMI20-030H-I：苏州纽迈分析仪器股份有限公司；FD-1C-80 真空冷冻干燥机：上海市比郎仪器制造有限公司；SIGMAHD扫描电子显微镜：德国蔡司（Carl Zeiss Microscopy GmbH）公司；杜马斯定氮仪DN2000：北京诺德泰科仪器仪表有限公司；凝胶电泳系统 Mini-Protein Tetra System、凝胶成像系统Chemi Doc MP：美国Bio-Rad 公司；紫外/可见光分光光度计A560：翱艺仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 玉米醇溶蛋白模拟面团粉质特性检测
将 zein、沙蒿胶和玉米淀粉按 10∶1∶39（w/w）的比例充分混合。基于Mixolab 的Chopin S 标准协议进行粉质实验，设定Mixolab 搅拌刀片转速80 rpm，揉混温度25 ℃。将混合好的原料粉置于Mixolab 中，加入乳酸水溶液，通过控制补加水量，使揉混最大扭矩达(1.1±0.05) Nm（相当于粉质仪500 FU）。制得面团中乳酸与原料粉比例（L/Z，mL/g）为0∶50、2∶50、4∶50、6∶50，分别记为Z0、Z2、Z4、Z6。实验重复3 次。
1.3.2 揉混不同时间玉米醇溶蛋白模拟面团制备
当Z0、Z2、Z4、Z6 揉混扭矩达1.1 Nm 时，停止揉混，此时所制面团分别记为ZS0、ZS2、ZS4、ZS6。
当Z0、Z2、Z4、Z6 揉混扭矩达1.1 Nm 后，继续揉混12 min，所制面团分别记为ZL0、ZL2、ZL4、ZL6。
将制得面团置于自封袋中，25 ℃下静置30 min 消去面团中应力后，进行后续检测。
1.3.3 面团中水分结合状态检测
参考刘锐[4]等的检测方法，并略作调整。分别将不同乳酸含量的ZS 和ZL 面团填充到聚四氟乙烯管中，尽量不让管内留有空隙。静置30 min后，于场强0.5 T 的永久磁场射频中心位置进行检测。测定样品的横向弛豫时间T2。设置TD 为360 000，SW 为200.00 kHz，TW 为4 000 ms，NS 为8。各面团重复制备3 次，平行检测2 次。
1.3.4 微观结构观测
参考WANG[5]的方法。将不同L/Z 比的ZS面团和ZL 面团，进行真空冷冻干燥，挑取截面平整的冻干面团固定于样品台上，用离子溅射仪对表面喷金，于2 KV 加速电压下，放大1 000 倍进行观测。
1.3.5 蛋白质脱酰胺度检测
Zein 会在酸性条件下发生脱酰胺反应，谷氨酰胺的侧链基团-NH2 被替换为-OH，N 含量下降[6]。借鉴李传雯[7]等的方法，通过测定蛋白质N含量的变化计算脱酰胺度。将T 和C 面团分别研磨成粉，用杜马斯定氮仪确定N 含量。设N0 为zein 中N 含量，N1 为脱酰胺反应后zein 中N 含量，根据下式计算脱酰胺度[8]：
1.3.6 蛋白质相对分子质量检测
参考LI[9]的方法。通过SDS-PAGE 表征zein的相对分子质量。将zein 分散于Tris-HCl 溶液中，加入甘油和SDS 充分搅拌，蛋白质上样10 μg。以Precision Plus Protein Dual Xtra 标准品用作分子量Maker，设定电泳仪电压260 V，电流13 mA。以40%甲醇、10%乙酸、50%水配置固定液固定条带，考马斯亮蓝G-250 染色过夜，10%乙酸对凝胶进行脱色。用凝胶成像仪成像。
Quantity One 对蛋白质条带灰度进行相对定量分析。分别以提取自面团的zein 条带总灰度为C1，以zein 的条带总灰度为空白对照（C0），按下式计算面团中zein 各条带灰度变化程度。
1.3.7 表面疏水性测定
参考SMITH[10]的方法。将提取自面团的zein加入到20 mM 的磷酸盐缓冲液（pH 6.0）中，蛋白质浓度5 mg/mL，震荡30 min。加入1 mg/mL的溴酚蓝去离子水溶液200 μL，磁力搅拌10 min。将样品液以4 000 rpm 离心15 min，用磷酸盐缓冲液对上清液稀释10 倍，充分震荡。用分光光度计，在595 nm 处测定吸光度A1。以0.1 mg/mL溴酚蓝去离子水溶液的吸光度A0 为检测空白。计算公式如下：
1.4 数据处理
所有实验至少重复2 次，平行3 次，结果以均值±标准方差表示。基于SPSS 21 软件对数据进行方差分析（ANOVA），置信区间P＜0.05。使用Origin 2018 软件绘图。
2 结果与讨论
2.1 粉质曲线
面团的揉混弱化是评价面团体系耐揉混性的重要指标，指面团成型时的揉混扭矩（1.1 Nm）与揉混12 min 后的扭矩差值。根据图1 中粉质曲线可知，相较不含乳酸的Z0 面团，添加乳酸的面团具有较好的耐揉混性，弱化得到一定程度的缓减，当面团中乳酸和zein 比例（L/Z）为2∶50（mL/g）时，即Z2 面团的耐揉混性最强，弱化仅为0.03 Nm，是Z0 的6.82%。但随着L/Z 增加，面团耐揉混性有所下降，弱化程度逐渐提高。这与已有研究结果一致[3]，认为添加少量的乳酸可以提高zein 模拟面团的耐揉混性，但长时间的揉混仍会导致酸化面团发生不同程度的弱化。
图1 Z0-Z6 粉质曲线及揉混弱化
Fig.1 Z0-Z6 farinographic curves and weakening degree
注：同列数据后的不同字母表示显著性差异（P＜0.05），下同。
Note: Different letters after the same column of data indicated significant differences (P＜0.05), the same below.
为探究酸化面团的弱化原因，就不同时长的揉混作用下，酸化面团中zein 理化性质及微观状态的差异展开讨论。
2.2 揉混时间对zein 混合面团微观结构的影响
有研究表明，制备无麸质黏弹性面团的关键，是面团中构建起蛋白骨架，形成连续稳定的蛋白网络[11]。在图2 中用红色箭头标注了面团中的zein，可观察到，ZS0 中的zein 聚集严重，分布不均，主要以带状或团块状的形式存在。相较于ZS0，ZL0 中，zein 聚集块粒径减小。说明揉混对面团中zein 聚集体有分化破碎作用，使之由大块蛋白聚集体转为小块聚集。
图2 ZS0-ZS6、ZL0-ZL6 的SEM 图像
Fig.2 SEM images of ZS0-ZS6 and ZL0-ZL6
在含有乳酸的ZS2、ZS4、ZS6 中，zein 均构建起了网状结构，认为乳酸可以抑制面团中zein聚集成块，有助于蛋白联结成网，该结果与先前的研究一致[2]。对于添加乳酸的Z 面团，长时间的揉混同样会导致zein 网络发生不同程度的弱化。比较同等L/Z 的ZS 和ZL 面团，发现相较刚刚揉混成型时，经长时间揉混，面团中zein 网络均趋于松散、薄弱，结构连贯性与完整性均有所下降，认为长时间的揉混作用会对酸化面团中zein 网络结构产生破坏。因此，适度揉混有助于构建酸化zein 模拟面团的蛋白网络结构，保障面团加工性能。
2.3 揉混时间对zein 模拟面团水分结合状态的影响
已有研究表明，水分是面团揉混成型与具备延展性的必要条件[12]，水分结合状态影响着面团质地和加工品质[13]。测得样品的低场核磁共振弛豫时间越小，表示水分流动性越弱[4]。信号峰面积与水分占比呈正比[14]。根据检测结果，将ZS和ZL 面团中的水分分为结合水（0.01～0.3 ms）、弱结合水（0.42～24.77 ms）、游离水（91.12～546.23 ms）三部分。结合水是与面团中组分紧密结合的水分[15]，主要通过静电力，与蛋白质和淀粉表面，以及淀粉无定形区内的极性基团相结合[16]；弱结合水是被包裹于蛋白质网络中和存在于淀粉颗粒间隙的水分，流动性介于结合水和游离水之间[17]；游离水通过毛细管作用存在于面团组分中[18]。
经揉混、静置，在面团中各组分的争夺下，水分被重新分配[19]。有研究发现，强筋小麦面团中致密的面筋网络有较好的水分束缚力，游离水占比较小，但经过度揉混，面筋网络被破坏，游离水占比随之增加[20]。Zein 模拟面团中游离水占比与面团中蛋白质网络的紧密程度同样相关。当L/Z 一定时，ZS 面团中弱结合水占比更高，而游离水占比较低。说明长时间的揉混弱化了zein 网络结构，相比ZL 面团，ZS 面团中zein 网络结构更为结实稳定，对体系中弱结合水的束缚能力更强，抑制了弱结合水向游离水的转化。
ERICKSON 等[21]发现增塑剂会影响到面团体系的质地，在油酸调控zein 团块拉伸性的研究中发现，油酸所起的增塑作用有效地增加了zein的延展性，但延展性的改善是以牺牲体系的强度为代价的。如表1 中数据可知，当L/Z 一定时，ZL 中的游离水占比明显高于ZS 的。结合zein 模拟面团粉质检测结果，分析认为随揉混时间增加，面团弱化程度的提高可能与游离水占比增加有关。在揉混作用下，存在于面团大分子组分间的游离水起到了增塑效果，减少了分子间摩擦，彼此纠缠水平降低，使面团质地变得更加柔软。
表1 ZS0-ZS6、ZL0-ZL6 水分结合状态
Table1 Contents of three forms of moisture in ZS0-ZS6 and ZL0-ZL6 %
注：同列数据后的不同字母表示显著性差异（P＜0.05）。
Note: Different letters after the same column of data indicated significant differences (P＜0.05).
面团名称 弱结合水占比 游离水占比ZS0 76.18±1.08A 0.92±0.23C ZS2 68.98±1.16B 0.69±0.14D ZS4 66.40±0.49C 1.76±0.09B ZS6 65.55±0.31C 2.37±0.13A ZL0 76.17±0.73a 0.95±0.22c ZL2 68.30±0.92b 1.10±0.21c ZL4 65.53±0.54c 2.54±0.14b ZL6 64.20±0.80d 3.35±0.33a
2.4 揉混时间对面团中zein 脱酰胺度的影响
在酸性条件下，富含谷氨酰胺的蛋白质会发生脱酰胺反应，谷氨酰胺残基上的-NH2 侧链基团被转化为-OH，由疏水性氨基酸被转化为中性的谷氨酸[22]。Zein 中20%以上的氨基酸为谷氨酰胺，发生脱酰胺反应的底物充足[23]。
当L/Z 一定时，相较ZS 面团，ZL 面团中zein的脱酰胺度更高。如图3 可见，其中ZL4 和ZL6中zein 的脱酰胺度分别达到ZS4 和ZL6 中zein的1.31 倍和1.25 倍。说明长时间的揉混对zein的脱酰胺反应起到促进作用，增加了反应程度。
图3 ZS0-ZS6、ZL0-ZL6 中zein 脱酰胺度
Fig.3 Deamidation degrees of zein in ZS0-ZS6 and ZL0-ZL6
2.5 揉混时间对面团中zein 相对分子质量的影响
对ZS 和ZL 面团中zein 相对分子质量的变化情况进行了检验与分析。根据图4-2（a）的SDSPAGE 可知，本研究所用蛋白质主要为α-zein，由35～48 kDa 的α-zein 二倍体和19、22 kDa 的α-zein单倍体组成。研究认为，脱酰胺反应会引起蛋白质的水解[24]。在反应中，谷氨酰胺的酰胺侧链被转化为带负电荷的羧酸基团，减少了分子内氢键，使蛋白质表面电负性增加，分子结构得以舒展，增加了肽键与H+的接触机率。
在本研究中发现，长时间的揉混会促进乳酸对面团中zein 的水解。如图4 数据可知，相较于ZS0，ZL0 中zein 的各条带灰度无显著变化（P＞0.05），说明在不添加乳酸的条件下，揉混过程对面团中zein 不存在显著的水解作用。在添加乳酸后，ZL2、ZL4、ZL6 面团中zein 条带总灰度变化程度，均分别显著大于ZS2、ZS4、ZS6，且随L/Z增加，ZL 中zein 条带灰度变化程度逐渐提高。由此认为，揉混过程会增加乳酸对面团中zein 的水解效果。
图4 ZS0-ZS6 和ZL0-ZL6 中zein 相对分子质量与条带灰度变化
Fig.4 Relative molecular mass and degree of change of band gray scale of zein in ZS0-ZS6 and ZL0-ZL6
2.6 揉混时间对面团中zein 表面疏水性的影响
有研究表明，表面疏水性反映了蛋白质表面的疏水基团分布情况，是蛋白质的重要特征[25]。基于表面疏水性，zein 可以联结彼此，构建起zein网络结构[26]。Zein 的脱酰胺反应及水解反应，均会影响到蛋白质的表面疏水性。
溴酚蓝（BPB）与蛋白质在疏水力的作用下会发生结合，可通过蛋白质的BPB 结合量来评价其表面疏水性。测得BPB 结合量越大，说明蛋白质与BPB 疏水作用结合能力越强，表面疏水性越大。
由图5 可知，ZS0 和ZL0 中zein 的BPB 结合量无显著差异（P＞0.05），说明当面团中不含乳酸时，揉混处理不会导致zein 的表面疏水性发生太大变化。随乳酸含量增加，面团中zein 表面疏水性呈先提高后下降趋势，与刘昊[3]等研究结果一致。ZS2 与ZL2 中zein 的表面疏水性之间无显著差异，而ZL4 和ZL6 中蛋白表面疏水性则分别远高于ZS4 和ZS6 中zein 所测结果。认为这是因为Z4 和Z6 中zein 相对分子质量下降明显，蛋白质碎片化，原本包埋于zein 结构内部的疏水性基团被充分暴露，蛋白表面疏水性大幅增加。
图5 ZS0-ZS6、ZL0-ZL6 中zein 溴酚蓝结合量
Fig.5 Bonud BPB of zein in ZS0-ZS6 and ZL0-ZL6
3 结论
以玉米醇溶蛋白（zein）、玉米淀粉、沙蒿胶为原料，制备了zein 模拟面团，探究了揉混时间对乳酸调控下面团弱化程度、水分组成情况，以及蛋白分布状态的影响规律；通过比较面团揉混成型时与揉混12 min 后，酸化面团中zein 理化性质的差异，探究了持续揉混造成面团弱化的原因，为zein 模拟面团的加工制备、相关谷物制品的开发提供技术参考。
研究发现，在不含乳酸时，zein 模拟面团耐揉混性差，弱化明显，但揉混作用不会造成zein的水解反应。长时间的揉混同样会导致酸化面团弱化，随乳酸含量增加，面团弱化程度加大，面团中zein 聚集团块粒径减小，蛋白网络连贯性被破坏程度增加，zein 对淀粉颗粒的包裹水平下降，弱结合水占比减小，游离水占比增加；面团中zein脱酰胺反应程度逐渐提高，相对分子质量下降，蛋白表面疏水性呈上升趋势。研究认为，揉混作用会促进酸化面团中zein 的表面疏水性增强、蛋白质碎片化，导致zein 网络连贯性下降，面团弱化。
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备注：本文的彩色图表可从本刊官网（http//lyspkj.ijournal.cn）、中国知网、万方、维普、超星等数据库下载获取。