双酚A（bisphenol A，BPA），学名为2,2-二对羟基苯基丙烷，可用于制造环氧树脂、聚碳酸酯、聚酚氧等多种高分子材料，被大量应用于食品塑料包装制品中，如饮用水瓶、植物油瓶、婴儿奶瓶等[1]。双酚A是脂溶性物质，在用于储存食品过程中，容易迁移到食品中，其毒性受到各国普遍关注。经科学家多年的毒理研究，发现其进入人体后，能影响内分泌、生殖和神经系统以及产生促癌等不良作用，特别是婴幼儿，可能导致婴儿荷尔蒙分泌异常和胸部发育障碍[1-2]，对消费者，特别是婴幼儿人群，存在着潜在的危害。因此，各国对于双酚A在食品包装材料中的使用进行了规范。2018年，欧盟发布法规（EU）2018/213规定食品接触材料中的双酚A的迁移限量为 0.05 mg/kg[3]，其中婴幼儿食品、特殊医疗用途食品、婴儿配方奶粉等专门针对婴幼儿的产品的接触清漆或涂层材料和塑料物品不得含有双酚A。欧盟认为含有双酚A的奶瓶会诱发性早熟，从2011年3月2日起，禁止生产含有双酚A的婴儿奶瓶。含有双酚A的热敏纸在部分发达国家已经禁止使用。双酚A也已被列入欧洲化学品管理局高度关注物质候选清单。此外，2018版OEKO-TEX® Standard100（世界上最权威的纺织品生态标签）也将双酚 A列入受限物质。2021年5月30日，我国卫生部等六部门下达禁令，禁止双酚A用于婴幼儿奶瓶中。为此我国出台《食品安全国家标准 食品接触材料及制品用添加剂使用标准》（GB 9685—2016），明确规定双酚 A用于食品接触塑料、涂料、粘合剂时，其特定迁移量应不超过0.6 mg/kg[4]。
目前，我国食用植物油产品包装容器主要为塑料容器，为了有效监测塑料容器可能对食用植物油储存带来的风险，我国将植物油中双酚A的风险评估监测列入国家计划，经监测，发现植物油中双酚A也有被检出的情况。但是，目前我国没有制定检测食用植物油中双酚A含量的国家标准或行业标准，影响植物油中双酚A风险评估的科学评价。现有相关双酚A检测国家标准有《食品安全国家标准 水产品中辛基酚、壬基酚、双酚A、已烯雌酚、雌酮、17烯雌乙炔雌二醇、17雌二雌二醇、雌三醇残留量的测定 气相色谱-质谱法》（GB 31660.2—2019），《化妆品中污染物双酚 A的测定 高效液相色谱-串联质谱法》（GB/T 30939—2014），《食品安全国家标准 食品接触材料及制品2, 2-二（4-羟基苯基）丙烷（双酚A）迁移量的测定》（GB 31604.10—2016），《食品接触材料 高分子材料 食品模拟物中 2,2-二（4-羟基苯基）丙烷（双酚A）的测定 高效液相色谱法》（GB/T 23296.16—2009），《化妆品中污染物双酚A 的测定 高效液相色谱-串联质谱法》（GB/T 30939—2014）《出口化妆品中双酚 A的测定 液相色谱荧光检测法》（SN/T 3822—2014），这些标准方法均不适用植物油中双酚 A的检测。
针对上述问题，本研究根据双酚A的特性，经查寻比对相关文献资料，提出采用高效液相色谱法检测植物油中双酚A含量方法，通过试验研究确定最优的检测条件，同时依据《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》（GB/T 27417—2017），对植物油中双酚 A含量的测定方法进行确认试验[5-6]。
1 材料和方法
1.1 设备和材料
Agilent 1260系列高效液相色谱仪（配有荧光检测器）：安捷伦科技（中国）有限公司；高速冷冻离心机：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；多管涡旋振荡器：莱普特科学仪器有限公司；水浴氮吹仪：上海旦鼎贸易有限公司；氨基固相萃取柱（500 mg，3 mL）：天津博纳艾杰尔科技有限公司。
双酚A标准物质，纯度为99.8%：中国计量科学研究院；乙腈（色谱级）、二氯甲烷（色谱级）、甲酸（色谱级）、甲醇（色谱级）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；实验用水为一级水。
1.2 实验方法
1.2.1 试剂配制
0.1%甲酸水溶液：吸取1 mL甲酸于1 000 mL容量瓶，加水定容，混匀后超声备用。
乙腈-0.1%甲酸水溶液（43+57，体积比）：取430 mL乙腈和570 mL 0.1-%甲酸水溶液，混匀。
1.2.2 标准溶液配制
双酚 A标准储备溶液：准确称取 0.016 7 g的双酚A标准品于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容。折算双酚A固体标准物质的纯度99.8%，实际配制标准储备溶液浓度为 666.7 μg/mL。在0～4 ℃下避光保存，有效期为6个月。
双酚 A标准中间储备溶液：准确移取666.7 µg/mL的双酚 A标准储备溶液 1 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解，再定容至刻度，配制成6.667 μg/mL双酚A标准工作溶液。在0～4 ℃下避光保存，有效期为2周。
1.2.3 仪器分析条件和前处理方法
1.2.3.1 仪器色分析条件 色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱，长250 mm，内径4.6 mm，粒径5 µm；流动相B相：乙腈，A相：0.1%甲酸溶液，梯度洗脱，使用前过滤并脱气；梯度洗脱条件：43% B（0～10 min），43%～100% B（10～12 min），100%～43% B（12～ 15 min），43% B（15～23 min）；柱温：40 ℃；荧光检测器：激发波长 230 nm；发射波长：313 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：50 µL。
1.2.3.2 前处理方法 称取1 g（精确至0.000 1 g）试样于15 mL具塞玻璃离心管中，加入5 mL乙腈，涡旋振荡5 min，在15 ℃下离心3 min（转速4 000 r/min），立即吸取上清液，收集于50 mL浓缩瓶中，试样中再加2次5 mL乙腈，分别重复上述涡旋提取步骤，合并3次上清液，于40 ℃旋转蒸发至近干，准确加入10 mL二氯甲烷溶解残渣，待净化。分两次准确移取试样提取液，每次2.5 mL，过氨基固相萃取柱，待样品溶液流完后，用二氯甲烷5 mL分两次淋洗固相萃取柱，弃去所有流出液，最后用乙腈7 mL分两次洗脱，用10 mL玻璃比色管收集洗脱液，40 ℃氮吹浓缩至近干，用1 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液溶解残留物，过0.22 µm有机微孔滤膜，收集滤液于进样瓶中，供高效液相色谱检测。
1.3 数据分析
通过色谱条件的优化、提取次数、洗脱体积优化，找出最佳色谱条件和样品前处理方法，在依据GB/T 27417—2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》进行方法确认，所有数据结果均按该标准附录A中要求进行评价分析。本实验中均应用Microsoft Excel进行数据处理和图表绘制，色谱图和标准曲线图均为Agilent 1260高效液相色谱仪操作软件导出图。
2 结果与讨论
2.1 色谱条件的优化
取植物油空白样品，通过加标回收试验的方式，对比空白样品和加标样品的色谱图，调节流动相比例，要求双酚A出峰处无干扰峰，且双酚A与其他峰的分离度达到1.5，再确定最佳的流动相比例。经多种条件试验，确定流动相为乙腈/0.1%甲酸水溶液梯度洗脱为最优的流动相条件，其中乙腈梯度为：43%（0～10 min），43%～100%（10～12 min），100%～43%（12～15 min），43%（15～23 min），色谱图见图1，出峰时间合适，目标物无干扰锋，分离度好。
图1 流动相梯度洗脱的色谱图
Fig.1 Chromatogram of gradient elution of mobile phase
2.2 提取次数的优化
参考国家标准GB 9685—2016中食品材料双酚 A的迁移限量为 0.6 mg/kg的规定，选择0.667 mg/kg加标浓度，考察不同提取次数时双酚A的回收率结果，以回收率的大小来确定最优提取次数，测定结果见表1，经比较检测结果，确定最优提取次数为3次。
表1 不同提取次数的回收率测定结果
Table 1 Determination results of recovery rates of different extraction times %
提取次数/次 1 2 3 4 5 6 6次测定结果的回收率 回收率平均值变异系数1 91.0 89.9 91.4 89.7 89.8 91.7 90.6 1.0 2 92.5 94.0 97.0 91.5 91.3 96.2 93.8 2.6 3 96.2 94.1 97.2 94.9 100.9 96.2 96.6 2.5
2.3 洗脱体积的选择
选择0.667 mg/kg加标浓度，考察5、7、10 mL不同体积乙腈洗脱氨基固相萃取柱时，双酚A的回收率情况，以回收率的大小来确定最佳洗脱液体积，测定结果见图2，经比较检测结果，确定最优洗脱液体积为7 mL。
图2 不同洗脱液体积的回收率测定结果
Fig.2 Determination results of recovery rates of different eluent volume
2.4 方法学性能考察
2.4.1 线性范围和相关系数
采用外标法配制标准曲线进行定量分析。配制8个标准曲线点，绘制的标准曲线见图3，浓度分别为 0.003 33、0.006 67、0.013 33、0.033 33、0.066 67、0.133 30、0.333 30、0.666 70 μg/mL，线性范围为0.003 33～0.666 70 μg/mL，相关系数为1，线性相关性良好。
图3 双酚A标准曲线
Fig.3 Bisphenol A of the standard curve
2.4.2 方法检出限
将双酚A标准溶液进行逐级稀释，测定其响应值，选择信噪比值在2～3的范围的浓度点进行方法检出限确认，确定浓度点为0.006 67 μg/mL，再通过空白样品加标方式进行确证。将其与空白样品的测量信号进行比较，确定达到或接近2倍信噪比响应值的可靠含量，再将该含量减小一倍进行加标试验，能达到2倍信噪比的概率应小于50%，该可靠含量即确证为方法检出限，测定结果见表2，确证方法检出限为0.007 mg/kg。
表2 方法检出限测定结果
Table 2 Determination results of the detection limit
编号 测定值/(mg/kg) 信噪比 定性结果1 0.003 03 1.1 阴性2 0.003 30 0.95 阴性3 0.003 08 1.1 阴性4 0.003 77 1.1 阴性5 0.003 37 2.1 阳性6 0.003 23 1.7 阴性1 0.006 86 2.3 阳性2 0.007 17 2.1 阳性3 0.006 04 2.1 阳性4 0.007 16 2.9 阳性5 0.006 69 3.3 阳性6 0.006 87 2.1 阳性
2.4.3 方法定量限
在空白样品中按 2倍方法检出限（即0.013 3 mg/kg）的添加量进行加标实验，确证方法定量限，平行测定6次，计算6次测定结果的回收率和变异系数，根据 GB/T 27417—2017中附录A和附录B的要求，加标量小于0.1 mg/kg的范围，回收率要求范围为60%～120%，精密度要求小于 15%，6次测定回收率范围为 92.6%～100.2%，详见表3。
表3 方法定量限测定结果
Table 3 Determination results of the quantification limit
编号 测定值/(mg/kg) 回收率/% 平均回收率/% 变异系数/%1 0.013 1 98.8 2 0.012 7 95.7 3 0.012 3 92.6 4 0.013 0 97.8 5 0.013 3 100.2 6 0.012 9 97.3 97.0 2.8
2.4.4 方法正确度
在空白样品中加入适量双酚A标准溶液进行加标回收实验，添加浓度水平分别为 0.033 3、0.333 3、0.667 0 mg/kg，每个点测定3次，计算回收率和变异系数，测定结果见表4。根据GB/T 27417—2017中附录A和附录B的要求，0.033 3、0.333 3、0.667 0 mg/kg回收率范围要求分别为60%～120%、80%～110%、80%～110%，精密度要求范围分别为小于15%、小于11%、小于11%，确定三个浓度水平的方法正确度均满足要求。
表4 方法正确度测定结果Table 4 Determination results of the accuracy
理论值/(mg/kg)/(mg/kg) 回收率/% 平均值/(mg/kg)测定值 变异系数/%0.033 30.032 0 96.20.033 2.5 0.033 6 101.0 0.033 2 99.8 0.333 00.327 0 98.3 0.313 0 94.0 0.320 2.3 0.318 0 95.5 0.667 00.642 0 96.2 0.628 0 94.1 0.639 1.6 0.648 0 97.2
2.4.5 方法精密度
选择0.033 3 mg/kg进行方法精密度验证，重复测定7次，计算其平均值和变异系数，测定结果见表5。结果表明，重复7次回收率结果满足GB/T 27417—2017中附录B中要求，回收率要求范围为60%～120%，精密度要求小于15%。经验证，7次测定回收率范围为92.6%～103.2%，平均回收率为99.1%，变异系数为2.8%，确定方法精密度满足要求。
表5 方法精密度测定结果
Table 5 Determination results of the precision
编号 测定值/(mg/kg)回收率/%理论加标值/(mg/kg)平均值/(mg/kg)变异系/%1 0.032 0 96.2 2 0.033 6 101.0 3 0.033 2 99.8 4 0.032 0 96.2 5 0.032 8 98.6 6 0.034 4 103.2 7 0.032 9 98.8 0.033 3 0.033 0 2.8
2.4.6 不同种类植物油的正确度确认
不同种类植物油空白样品的加标含量水平均为0.333 mg/kg，通过回收率结果进行评价，要求回收率范围在80%～110%，且平行试验的相对相差均小于 11%，测定结果见表6。结果表明，在0.333 mg/kg含量水平，对于不同种类植物油的回收率和相对相差结果均符合要求，本方法正确度均能满足要求。
表6 不同种类植物油正确度测定结果
Table 6 Results of accuracy determination of different vegetable oils
植物油 测定值/(mg/kg)回收率/% 平回收率/%相对相差/%大豆油0.326 97.897.9 0.4 0.327 98.1 0.338 101.6花生油101.2 0.8 0.336 100.8 0.335 100.7菜籽油100.3 0.8 0.333 99.9 0.318 95.4葵花籽油95.9 1.0 0.321 96.4 0.331 99.3调和油96.9 5.1 0.314 94.4 0.303 91.1玉米油91.0 0.2 0.303 90.8 0.320 96.1山茶油95.2 1.9 0.314 94.2
3 结论
本研究在优化检测条件的基础上，建立了高效液相色谱法检测植物油中双酚A含量的方法。经方法性能学考察，方法检出限为0.007 mg/kg，定量限为0.013 mg/kg，7次重复测定结果的变异系数为 2.8%，方法的回收率范围为 90.8%～103.2%。结果表明，该方法满足植物油中双酚A含量测定需要，检测成本低，适应范围广，前处理设备简单且易操作，可为检测植物油中双酚A含量方法的建立以及监管实施和评价提供技术参考。
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备注：本文的彩色图表可从本刊官网（http//lyspkj.ijournal.cn）、中国知网、万方、维普、超星等数据库下载获取。