龙山小米特产于山东省济南市章丘区，是全国农产品地理标志，也是历史上全国四大贡米之一。龙山小米香味浓郁且营养丰富，富含多种微量元素和生物活性成分[1-4]。目前龙山小米主要以鲜销为主，通过精深加工制备的高附加值产品较少，产业产值较低，亟需转型升级。γ-氨基丁酸广泛存在于谷物作物中，具有降血压、改善脑机能、防止动脉硬化等功能，植物性来源的γ-氨基丁酸产品因其安全性、天然性的特点备受研究者关注[5-7]。已有研究表明，通过谷物发芽的方式，可有效提高谷物中γ-氨基丁酸含量，并进行高附加值产品开发[8-10]。
神经网络（Artificial neural networks，ANN）是一种数据分析方法，通过模仿大脑的神经网络行为特点对数据进行处理，具有极强的非线性映射能力，广泛应用于生物、农业、机械等领域的模型建立[11-12]。遗传算法(（Genetic algorithm，GA)是一种基于人工智能的随机非线性优化方式，可实现随机、自适应、并行性全局搜索寻优[11-12]。通过遗传算法结合神经网络进行工艺优化，可有效避免传统优化方法易产生局部最优解的情况，更适合进行全局最优组合设计[11-15]。将神经网络算法应用于龙山小米 γ-氨基丁酸富集工艺的研究尚未见报道。
本研究将神经网络应用于龙山小米 γ-氨基丁酸富集工艺优化，以期为龙山小米产品开发提供新思路，延伸龙山小米加工产业链，推动地方特色农产品经济发展，促进我国新旧动能转换。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
小米，章丘龙山小米（糙米）：购于山东省济南市章丘区；
γ-氨基丁酸标准品，色谱纯级：美国 Sigma公司；乙腈，色谱纯级：美国TEDIA公司；磷酸，分析纯级：北京化工厂；硼酸、邻苯二甲醛、巯基乙醇、氢氧化钠、醋酸、三乙胺、四氢呋喃、2-辛醇、甲醇，分析纯级：国药集团化学试剂有限公司；三水乙酸钠，分析纯级：源叶生物有限公司。
1.2 仪器与设备
XS 365M电子天平：瑞士普里赛斯仪器有限公司；DS-56III双螺杆挤压膨化机：济南赛信机械有限公司；500Y型高速多功能粉碎机：浙江锐腾食品机器有限公司；UV1000分光光度计：上海天美科学仪器有限公司。
MA160-1CN型水分分析测定仪：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；SPX-150B-Z型生化培养箱：上海博远实业有限公司；KQ-600E超声波振荡器：昆山舒美有限公司；2695型液相色谱仪：沃特世科技（上海）有限公司；500Y型紫外检测器：Empower工作站。
1.3 实验方法
1.3.1 工艺流程
龙山小米→清洗→浸泡→发芽（富集 γ-氨基丁酸）→干燥
1.3.2 单因素实验
取一定量龙山小米不发芽作为空白组，另取一定量龙山小米作为实验组置于烧杯中，室温浸泡一段时间后，置于培养箱中一定温度下发芽。以 γ-氨基丁酸含量为指标，单因素实验条件分别为浸泡时间4、8、12、16、20 h；发芽温度25、30、35、40、45 ℃；发芽时间 12、24、36、48、60 h。考察单因素实验条件时，设置固定条件为浸泡时间12 h；发芽温度40 ℃；发芽时间48 h。分别测定空白组和实验组γ-氨基丁酸含量。
1.3.3 响应面优化实验
以浸泡时间（X1）、发芽温度（X2）和发芽时间（X3）作为自变量，样品γ-氨基丁酸含量作为因变量（y），进行N=17的响应面（Box-Behnken）优化实验，结合单因素实验最优结果，在满足最优工艺范围的情况下，设置因素水平编码表见表1。
表1 因素水平编码表
Table 1 Factor level coding table
水平 浸泡时间/h 发芽温度/℃ 发芽时间/h 1 16 40 54 0 12 35 48-1 8 30 44
1.3.4 BP神经网络
设置该神经网络模型拓扑结构为 3-10-1，其中神经网络设置输入层为3个神经元，即浸泡时间（X1）、发芽温度（X2）和发芽时间（X3）；设置1个隐含层，包含10个神经元，以满足输入层数据计算；将γ-氨基丁酸含量（Y）设为输出层；通过模拟龙山小米发芽过程中的 γ-氨基丁酸含量变化，确定相关因素对龙山小米 γ-氨基丁酸含量的影响。拓扑结构图见图1。
图1 神经网络拓扑结构
Fig.1 The architecture of artificial neural network
本次优化以建立的神经网络模型为遗传算法的适应度函数，利用适应度函数对个体进行选择，进而对龙山小米γ-氨基丁酸富集工艺进行寻优。
1.3.5 γ-氨基丁酸测定
采用高效液相色谱法测定γ-氨基丁酸的含量，测定方法结合NY/T 2890—2016《稻米中γ-氨基丁酸的测定 高效液相色谱法》和 QB/T 4587—2013《γ-氨基丁酸》。
称取一定量样品，研磨后过60目筛，加入一定量乙醇水溶液，超声提取后静置离心，取上清液，样品残渣进行2次提取，合并上清液。加入一定量邻苯二甲醛-乙腈衍生剂，反应后进样。
色谱分析条件：流动相分为A相和B相。A相：称一定量的结晶乙酸钠，定容至1 000 mL，加一定量三乙胺，调整pH至7.20后加四氢呋喃，混合过滤备用。B相：按A相的方法配置，调好pH后按照体积比为甲醇∶乙酸钠∶乙腈=2∶1∶2混合过滤备用。柱温40 ℃、流速1.0 mL/min、检测波长：338 nm。
1.4 数据分析
数据差异显著性通过软件 SPSS 22.0进行分析，响应面优化实验通过软件Design Expert 8.0进行分析，神经网络建模和遗传网络寻优通过软件Matlab 2018b进行。
2 结果与分析
2.1 工艺优化结果
2.1.1 单因素实验
浸泡时间对样品γ-氨基丁酸含量的影响见图2。
图2 浸泡时间对γ-氨基丁酸含量的影响
Fig.2 Effect of soaking time on γ-aminobutyric acid content
注：不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
Note: different letters indicate significant difference (P＜0.05).
由图 2可知，随着浸泡时间的上升，γ-氨基丁酸含量先显著上升，当达到12 h后呈下降趋势。分析原因为在小米浸泡过程中，小米吸水提高自身生物酶活性，促进胚乳中的干物质转化为供给胚乳、发芽所需的营养成分，有利于 γ-氨基丁酸生成，故浸泡时间小于12 h时γ-氨基丁酸含量显著上升。当浸泡时间过长时，细胞结构损伤导致水溶性物质溶出，γ-氨基丁酸含量降低。故选择12 h为单因素最适浸泡时间。
发芽温度对样品γ-氨基丁酸含量的影响见图3。随着发芽温度的上升，γ-氨基丁酸含量呈现先显著上升，当达到 35 ℃后呈下降趋势。分析原因为发芽温度过高或者过低，都将抑制小米中谷氨酸脱羧酶的活力，进而抑制γ-氨基丁酸的生成[6]。故选择35 ℃为单因素最适发芽温度。
图3 发芽温度对γ-氨基丁酸含量的影响
Fig.3 Effect of germination temperature on γ-amino butyric acid content
注：不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
Note: different letters indicate significant difference (P＜0.05).
发芽时间对γ-氨基丁酸含量的影响见图4。
图4 发芽时间对γ-氨基丁酸含量的影响
Fig.4 Effect of germination time on γ-amino butyric acid content
注：不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
Note: different letters indicate significant difference (P＜0.05) .
由图 4可知，随着发芽时间的上升，γ-氨基丁酸含量呈先显著上升，当48 h后下降的趋势。分析原因为，小米蛋白在蛋白酶作用下生成谷氨酸，谷氨酸脱羧酶将谷氨酸转化为γ-氨基丁酸，但较高的γ-氨基丁酸生成量，将激发γ-氨基丁酸转氨酶的活性，使γ-氨基丁酸转化为琥珀酸半醛，故过长的发芽时间，γ-氨基丁酸含量下降[8]。选择48 h为单因素最适发芽时间。
2.1.2 响应面实验优化
响应面优化实验结果见表2。
表2 响应面优化实验结果
Table 2 Test results of response surface optimization
序号 X1浸泡时间 X2发芽温度 X3发芽时间 Yγ-氨基丁酸含量1 0 -1 -1 337.92 2 1 1 0 372.24 3 0 0 0 438.87 4 -1 0 1 343.65 5 1 0 1 367.42 6 -1 0 -1 316.72 7 1 0 -1 349.87 8 0 0 0 439.99 9 0 1 -1 367.31 10 1 -1 0 362.11 11 -1 1 0 364.43 12 0 0 0 442.54 13 0 0 0 441.90 14 0 0 0 438.25 15 0 1 1 385.45 16 0 -1 1 369.62 17 -1 -1 0 323.59
使用 Design Expert 8.0.6中的 Box-Behnken模块进行响应面优化，得到Y二次多项方程
该二次项模型R2=0.98，说明该模型仅有2%的总量变异不能由模型因素解释，同时模型信噪比=71.01＞4，说明该模型拟合程度较好，优化结果较为可信。模型方差分析结果如表3所示。
由表3可知，该预测模型项P＜0.000 1，呈极显著水平，模型失拟项P=0.245 2，呈不显著水平，同时模型 X1、X2、X3、X1X2、X12、X22、X32 项呈极显著水平，模型X2X3项呈显著水平，说明该预测模型拟合程度良好。
各因素对响应值的影响见图 5。由图 5结合表3可知，浸泡时间和发芽温度交互作用对γ-氨基丁酸含量影响极显著（P＜0.01），发芽时间和发芽温度交互作用对 γ-氨基丁酸含量影响显著（P＜0.05），浸泡时间和发芽时间交互作用对 γ-氨基丁酸含量影响不显著（P＞0.05）。
图5 各因素交互作用对γ-氨基丁酸含量影响的响应面和等高线图
Fig.5 Contours and response surface diagrams of the effects of various factors on the γ-amino butyric acid content
表3 方差分析
Table 3 Analysis of variance
方差来源 平方和 自由度 均方差 F值 P值 显著性模型 30 430.28 9 3 381.142 663.654 5 ＜0.000 1 极显著X1 1 332.57 1 1 332.57 261.558 5 ＜0.000 1 极显著X2 1 156.565 1 1 156.565 227.011 8 ＜0.000 1 极显著X3 1 112.033 1 1 112.033 218.271 1 ＜0.000 1 极显著X1X2 235.776 1 235.776 46.278 39 0.000 3 极显著X1X3 21.996 1 1 21.996 1 4.317 42 0.076 3 X2X3 45.968 4 1 45.968 4 9.022 731 0.019 8 显著X1 2 11 688.86 1 11 688.86 2 294.303 ＜0.000 1 极显著X2 2 4 319.33 1 4 319.33 847.803 1 ＜0.000 1 极显著X3 2 7 860.126 1 7 860.126 1 542.795 ＜0.000 1 极显著残差 35.663 13 7 5.094 732失拟 21.742 53 3 7.247 508 2.082 528 0.245 2 不显著纯误差 13.920 6 4 3.480 15总和 30 465.94 16
2.1.3 BP神经网络的建立与训练
神经网络误差下降曲线图如图6所示。随着训练次数的增加，模型的均方误差逐渐逼近最优误差值。当神经网络训练迭代到157次时，训练误差达到最优值0.000 2，表明该神经网络模型可信性较高。
图6 BP神经网络均方误差图
Fig.6 MSE curve of BP neural network
BP神经网络模型训练的相关系数见图7。当训练误差为0.000 2时，BP神经网络模型训练的相关系数为 0.999（R＞0.95），结果表明本次训练的BP网络模型对于训练样本逼近能力较高，能较好的描述浸泡时间、发芽温度、发芽时间和样品 γ-氨基丁酸含量间的关系，可以用于本工艺优化。
图7 BP神经网络训练相关系数图
Fig.7 Correlation coefficient diagram of BP neural network training
模型随机验证结果见图8。在17组实验数据中随机选择 3组数据，对 BP神经网络模型进行验证，结果表面3组数据实际值与模型预测值误差分别为4.75%、0.25%、0.5%，误差均小于10%，说明该模型预测性较好。
图8 模型随机验证结果
Fig.8 Model random verification results
利用人工神经网络（ANN）预测各因素对γ-氨基丁酸含量的影响见图9。
图9 利用ANN预测各因素交互作用对γ-氨基丁酸含量的影响
Fig.9 Using ANN to predict the impact of various factors on γ-amino butyric acid
由图9可知，浸泡时间、发芽温度和发芽时间对 γ-氨基丁酸含量都有较大影响且相互间存在交互作用，γ-氨基丁酸在该模型中存在全局最优。说明本次建立的BP神经网络具有较好的预测性，可以明确输入数据和输出数据之间的关系，作为模拟小米发芽富集γ-氨基丁酸过程的预测工具。
2.1.4 遗传算法寻优
图10为遗传算法寻优的适应度曲线。
图10 适应度曲线
Fig.10 The fitness curve
由图10可知，遗传算法（GA）能够进一步完善实验的优化工艺并在模型中寻找最优值。随着遗传进化迭代次数的增加，适应度值首先呈断崖式下降，随后又进行了3次选择处理，被选择个体的适应度值产生小范围的改变，并逐步向最优适应度值逼近，适应度曲线在进行51次迭代时收敛于最优适应度。通过循环迭代处理，当进化代数增大至60代时，GA 停止选择并得出适应度值最高的个体。运行出的优化结果：最优工艺参数为浸泡时间11.7 h，发芽温度38.5 ℃，发芽时间49.4 h，最优γ-氨基丁酸含量为445.75 mg/kg。根据模型优化方案结合实验设备可设置参数实际情况进行验证实验，相关结果如表4所示。
表4 模型优化结果及验证比较
Table 4 The optimization results and comparative validation
γ-氨基丁酸含量/(mg/kg)制备工艺 浸泡时间/h发芽温度/℃发芽时间/h实验值 模型优化值验证实验 11.5 38.5 49.5 444.03 445.75
由表4可知，验证实验的γ-氨基丁酸含量为444.03 mg/kg，比模型优化值 445.75 mg/kg低0.39%，实验相对误差维持在±5%的范围内，达到了该模型对实验精确度的要求。GA-BP 神经网络优化的最佳条件为：浸泡时间 11.5 h，发芽温度38.5 ℃，发芽时间49.5 h。未处理的龙山小米γ-氨基丁酸含量为66.46 mg/kg，通过最优富集工艺处理后的龙山小米γ-氨基丁酸含量提高5.68倍。
3 结论
通过对龙山小米进行发芽富集 γ-氨基丁酸，研究浸泡时间、发芽温度和发芽时间对龙山小米γ-氨基丁酸含量的影响。在单因素实验的基础上，运用Design Expert 8.0中Box-Behnken模块进行3因素3水平的响应面实验设计，通过matlab2018b建立 BP神经网络模型，结合遗传算法最终确定最优工艺参数。龙山小米 γ-氨基丁酸富集最优工艺为：浸泡时间11.5 h，发芽温度38.5 ℃，发芽时间49.5 h。在此工艺下龙山小米γ-氨基丁酸含量为444.03 mg/kg，相比未处理样品含量提高5.68倍。通过 BP神经网络的模型优化，对龙山小米富集 γ-氨基丁酸的工艺提供数据参考，可推动龙山小米产业提质增效，带动地方特色农产品经济发展。但本研究的γ-氨基丁酸富集工艺为传统发芽法，尚需结合生物酶法、改性等技术手段进行深入研究，进一步提高γ-氨基丁酸富集效果。
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备注：本文的彩色图表可从本刊官网（http//lyspkj.ijournal.cn）、中国知网、万方、维普、超星等数据库下载获取。