玫瑰（Rosa rugosaThunb.）属蔷薇目蔷薇科落叶性灌木，在我国具有悠久的栽培历史，目前在全国各地均有种植，其中以华北、西北、西南等地为主[1-2]。山东平阴县是中国最大的玫瑰花种植基地，玫瑰花资源十分丰富，其“平阴重瓣红玫瑰（Rose rugosa cv. Plena）”是原国家卫生部于2010 年认证的新资源食品和药食同源品种，在食品、医药等领域有着广阔的应用前景[3-4]。
重瓣红玫瑰花在提取玫瑰精油后剩余大量的固体花渣，这些花渣的营养成分丰富，但目前生产中大部分作为废弃物直接处理掉了，这不仅污染了环境，也是对资源的浪费[5-6]。研究发现，玫瑰精油的提取只是将玫瑰花的香气等可挥发性成分提取出来，而其他（如蛋白质、膳食纤维、矿物质、多酚类和黄酮类等）非挥发性成分都留在了提取后剩余的花渣中，具有很高的再利用价值[7-10]。因此，提取玫瑰花渣中的功效成分，提高花渣的再利用率具有重要的研究意义和应用前景。
目前，关于玫瑰花中功能性成分开发较多[11-12]，但是从花渣中提取功能性成分的研究报道较少。玫瑰花渣成分复杂，含有多酚类、黄酮类等多种化学成分，具有减少和消除自由基、抗氧化活性、抗血栓、抗癌、抗炎、抗菌、免疫调节、降血脂和预防心脏病等生理活性[13-15]。同时，玫瑰花渣中还含有蛋白质、VC 和膳食纤维等多种营养成分，其中所含氨基酸中必需氨基酸所占比例较高，所含不饱和脂肪酸中亚油酸所占比例较高，总脂肪含量较低[7,9]。在花渣成分提取技术研究中，主要的提取方法有溶剂提取法[10,16]、碱提取[17]、加热提取[18]、酶辅助提取[19]、微波辅助提取[20]、超声波辅助提取[21-22]等。超声辅助提取法在多酚提取中表现出较高的提取效率，近年来被广泛应用于植物源化合物的提取。谢琼等[23]用超声提取了玫瑰花渣中的总黄酮，确定了超声提取的最佳工艺条件。张佳婵等[8]采用醇提法提取了玫瑰花和花渣中的黄酮成分，所得黄酮冻干粉对羟自由基、ABTS +自由基和DPPH 自由基均具有清除能力。马猛华等[9]提取了玫瑰花渣中的多糖和黄酮类化合物，优化了各自的提取工艺。
目前研究较多的是大马士革玫瑰花渣、苦水玫瑰花渣等的成分提取及其功能性分析，而对于重瓣红玫瑰花渣的研究相对较少[21,24-26]。基于此，本项目以重瓣红玫瑰花精油提取后产生的玫瑰残渣废弃物为原料，研究其中黄酮类化合物的提取工艺，同时考察黄酮类化合物的抗氧化活性和抑菌活性，以期为提高重瓣红玫瑰花的综合利用价值提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
重瓣红玫瑰花渣：山东省平阴玫瑰精油生产基地；芦丁标准品（HPLC≥98%）：北京索莱宝科技有限公司；DPPH（纯度>96%）、ABTS（纯度>98%）：上海麦克林生化科技有限公司；羟自由基测试盒：南京建成生物工程研究所；氢氧化钠、过硫酸钾、硝酸铝、无水乙醇、亚硝酸钠，均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司。
指示菌：金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus ATCC 25923、蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus ATCC 11778、大肠杆菌Escherichia coli ATCC 44752：河北科技大学酶工程实验室保存。
1.2 仪器与设备
紫外可见分光光度计（Evolution 220）：美国Thermo 公司；全自动菌落计数仪（Scan-1200）：法国Interscience 公司；超净工作台（SW-CJ-1FD）：苏州安泰空气技术有限公司；恒温培养箱（SPX-150）、水浴恒温震荡器（SHZ-A）、数显鼓风干燥箱（GZX-9140MBE）：上海博讯实业有限公司；电子天平（JJ-1000）：常熟市双杰测试仪器厂；恒温摇床（ZHWY）：上海智城分析仪器制造公司；牛津杯（内径6.0 mm，外径7.8 mm）：武汉药科新技术开发公司；离心机（4-16KS）：德国Sigma 公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样品预处理
玫瑰花固体渣放置于40 ℃烘箱内恒温干燥4 h，烘干后粉碎，将所得粉末状样品后，低温密封保存备用。
1.3.2 黄酮标准曲线的绘制
本试验以芦丁为标准品对玫瑰花渣中总黄酮含量进行测定。配置不同浓度的芦丁溶液，利用亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等试剂与芦丁标准品溶液进行反应，利用紫外分光光度计在510 nm处测得吸光值，并以吸光值为纵坐标，芦丁浓度为横坐标做标准曲线。
1.3.3 玫瑰花渣中总黄酮提取条件的优化
1.3.3.1 乙醇浓度的优化 准确称取重瓣红玫瑰花渣粉1.0 g，按照1∶15 的料液比，分别溶于体积分数为55%、60%、65%、70%、75%的乙醇溶液中，于40 ℃、120 r/min 水浴震荡1.5 h，离心除蛋白后得到样品，按照标准曲线方法进行操作，测定黄酮含量。
1.3.3.2 提取时间的优化 准确称取玫瑰花渣粉1.0 g，按照料液比1∶15 溶于体积分数60%的乙醇，将溶解好的溶液置于恒温震荡器中40 ℃、120 r/min 水浴震荡，设置时间为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，离心除蛋白后得到样品，按照标准曲线的测定方法测定黄酮含量。
1.3.3.3 提取料液比的优化 准确称量玫瑰花渣粉1.0 g，分别按照料液比为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 溶解于体积分数为60%的乙醇，将溶解好的溶液置于恒温震荡器中，40 ℃、120 r/min水浴震荡1.5 h，离心除蛋白后得到样品，按照标准曲线的测定方法测定黄酮含量。
1.3.3.4 提取温度的优化 准确称取玫瑰花渣粉1.0 g，按照料液比为1∶30 的比例，溶于体积分数为60%的乙醇，分别置于40、50、60、70、80、90 ℃恒温震荡器，水浴震荡提取1.5 h，离心除蛋白后得到样品，按照标准曲线方法测定黄酮含量。
1.3.4 玫瑰花渣中总黄酮超声波辅助提取条件的正交实验
采用L25（56）正交实验对玫瑰花渣中总黄酮提取条件进行优化，确定最佳的提取工艺条件。正交表如表1 所示：
表1 正交表
Table 1 Orthogonal table
水平 A 超声时间/min B 超声功率/W C 超声温度/℃1 15 100 40 2 30 120 50 3 45 140 60 4 60 160 70 5 75 180 80
1.3.5 玫瑰花渣总黄酮的抗氧化性的测定
1.3.5.1 对 DPPH·自由基的清除效率 参照Ravindran 等[27]的方法，将上述条件下得到的黄酮提取液，稀释5 个合适梯度，分别对不同浓度的样品进行一组实验：在第一只试管中加入1 mL黄酮提取液和3 mL、50 µg/mL 的DPPH 溶液，充分混匀后于室温下避光反应30 min；在第二只试管中加入1 mL 黄酮提取液和3 mL 无水乙醇；在第三只试管中加入1 mL 无水乙醇和3 mL 的DPPH 溶液。蒸馏水调零后，于517 nm 下测定每组三支试管的吸光值，分别将吸光值记作Ac、Ad、Ak。按照公式（1）计算黄酮提取液对DPPH·自由基的清除率：
1.3.5.2 对ABTS+自由基的清除效率 参照Yan等[1]的方法，将7 mmol/L 的ABTS 和2.45 mmol/L的过硫酸钾按照1∶1（v/v）均匀混合后，室温下避光放置24 h 备用。用95%乙醇溶液稀释配置好的ABTS 溶液至波长734 nm 处的吸光度值在(0.7±0.02) nm 内，作为 ABTS+测定溶液。取制备好的黄酮提取液进行试验：0.4 mL 待测样液，加入ABTS+测定溶液3.6 mL，静置5 min，于734 nm波长处测定吸光度。按照如下（2）公式计算黄酮提取液对ABTS+自由基的清除率：
式中：Amax 为ABTS+测定溶液的吸光值；As 为样品管的吸光值。
1.3.5.3 对羟自由基清除效率 将提取后的黄酮提取液使用羟自由基测定试剂盒进行羟自由基（·OH）清除率的测定，将所得结果代入（3）公式，计算的羟自由基清除率：
抑制羟自由基能力（U/mL）=
式中：标准品浓度为8.824 mmol/L，取样量为1 mL，n 为样品测试前稀释倍数。
1.3.6 玫瑰花渣总黄酮的抑菌性研究
采用牛津杯扩散法[28]，选用金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 25923、蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus ATCC 11778、大肠杆菌Escherichia coli ATCC 44752 为指示菌进行抑菌实验。将指示菌的菌悬液（108 CFU/mL）按照1%的添加量加入到与营养琼脂培养基中，倾倒灭菌平板，在平板的牛津杯中添加50 µL 玫瑰花渣的黄酮提取液，预扩散后恒温培养箱培养，抑菌圈测量仪测定抑菌圈直径。
1.4 数据分析
每个实验组设三个平行，数据采用Microsoft Office Excel 2007 进行处理，正交设计助手专业版V3.1 破解绿色版对数据进行分析。
2 结果与分析
2.1 玫瑰花渣中总黄酮提取条件的优化
2.1.1 乙醇浓度对玫瑰花渣中黄酮提取的影响
不同浓度乙醇提取重瓣红玫瑰花渣中黄酮结果见图1。图1 结果显示，随着乙醇浓度的提高，黄酮提取量先增大后减小，这可能是因为乙醇浓度较大时，玫瑰花渣中的其他成分会被浸提出来从而影响了玫瑰黄酮的析出。在乙醇浓度为60%时黄酮含量最高，达到7.47 mg/g。周小琦[14]的实验结果为当乙醇浓度为65%时黄酮含量最高为3.68 mg/g。
图1 乙醇浓度对玫瑰花渣中黄酮提取的影响
Fig. 1 Effect of ethanol concentration on the extraction of flavonoids from rose residue
2.1.2 提取时间对玫瑰花渣中黄酮提取的影响
不同提取时间对玫瑰花渣黄酮提取的影响见图2。由图2 结果可知，随着提取时间的增大，黄酮提取量先增大后减小，可能是随着时间的延长，花渣中其它杂质也会浸出，因此最佳提取时间为1.5 h，黄酮含量达到11.48 mg/g。
图2 提取时间对玫瑰花渣中黄酮提取的影响
Fig. 2 Effect of extraction time on the extraction of flavonoids from rose residue
2.1.3 提取料液比对玫瑰花渣中黄酮提取的影响
不同提取料液比对玫瑰花渣中黄酮提取的结果见图3。由图3 可知，料液比为1∶30 的时候，黄酮的提取量最高，达到了15.83 mg/g，这可能是因为溶剂量大时，黄酮溶出的较多。因此，本研究选择重瓣红玫瑰花渣黄酮的最佳提取料液比为1∶30。
图3 料液比对玫瑰花渣中黄酮提取的影响
Fig. 3 The effect of ratio of material to liquid on the extraction of flavonoids from rose residue
2.1.4 提取温度对玫瑰花渣中黄酮提取的影响
不同提取温度对玫瑰花渣黄酮影响的结果见图4。由图4 可知，黄酮提取量随温度的升高先增大后减小，可能温度过高会破坏黄酮结构，所以最适宜提取温度为80 ℃时，黄酮提取量达到22.43 mg/g。
图4 提取温度对玫瑰花渣中黄酮提取的影响
Fig. 4 Effect of extraction temperature on the extraction of flavonoids from rose residue
2.2 玫瑰花渣中总黄酮超声波辅助提取条件的优化
对超声辅助提取的提取条件进行正交试验优化，优化的结果见表2。由表2 结果可得出最优组合为A3B3C3，即超声处理时间为45 min、超声温度为60 ℃、超声功率为140 W，在此条件下黄酮含量达到58.53 mg/g。宋可珂[29]筛得最优提取妙峰山玫瑰黄酮条件下，含量达到66.040 mg/g。牛元[30]采用紫外分光光度计法测定黄酮含量，苦水玫瑰花蕾中黄酮含量为93.056 mg/g。
表2 正交优化实验结果
Table 2 Results of orthogonal experiments
试验号 A 超声时间/min B 超声功率/W C 超声温度/℃总黄酮含量/（mg/g）1 1 1 1 41.17±0.95 2 1 2 2 38.69±0.81 3 1 3 3 44.62±0.88 4 1 4 4 46.23±1.20 5 1 5 5 44.02±0.91 6 2 1 2 24.20±0.32 7 2 2 3 31.14±0.44 8 2 3 4 23.55±0.40 9 2 4 5 21.76±0.37 10 2 5 1 41.66±1.12 11 3 1 3 55.65±0.87 12 3 2 4 49.17±0.99 13 3 3 5 38.79±0.75 14 3 4 1 42.41±0.91 15 3 5 2 37.18±0.89 16 4 1 4 35.19±0.75 17 4 2 5 35.12±0.69 18 4 3 1 39.06±0.41 19 4 4 2 36.11±0.57 20 4 5 3 34.41±0.53 21 5 1 5 42.18±0.84 22 5 2 1 36.02±0.76 23 5 3 2 52.53±1.23 24 5 4 3 35.94±0.61 25 5 5 4 36.66±0.64 K1 42.95 39.68 40.06 K2 28.46 38.03 37.74 K3 44.64 39.71 40.35 K4 35.97 36.49 38.16 K5 40.67 38.79 36.37 R 16.18 3.22 3.98
2.3 黄酮的抗氧化性的测定
2.3.1 黄酮对DPPH·自由基的清除效率
根据实验结果所得吸光值，代入计算公式，得到黄酮对于 DPPH·自由基的清除率最高为91.58%。杨虎[21]筛得最优提取玫瑰黄酮条件下，对DPPH·的清除率为88.28%。
2.3.2 黄酮对ABTS+自由基的清除效率
经计算，黄酮对 ABTS+自由基的清除率为73.71%。陆秀云[26]玫瑰废水中黄酮对ABTS+的最大清除率为98.96%。
2.3.3 黄酮对羟自由基清除效率
经计算，黄酮提取液对羟自由基的抑制能力为467.91 U/mL。
2.4 黄酮的抑菌性研究
由玫瑰花渣黄酮的抑菌实验结果见表3、图5。由表3、图5 可知，黄酮提取液对大肠杆菌没有明显的抑菌效果，对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌具有抑制性，尤其是对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，其抑菌圈均大于14 mm。
表3 黄酮提取液对细菌的抑菌圈
Table 3 Bacteriostatic circle of flavonoid extract on bacteria
指示菌抑菌圈/mm黄酮提取液浓度/（mg/mL）对金黄色葡萄球菌对蜡样芽孢杆菌对大肠杆菌2 14.3±0.35 9.66±0.23 0 3 15.77±0.56 10.96±0.41 0
图5 黄酮提取液对蜡样芽孢杆菌（a）和金黄色葡萄球菌（b）的抑菌效果
Fig.5 Antibacterial effect of flavonoid extract on A (Bacillus cereus) and B (Staphylococcus aureus)
3 结论
根据上诉实验结果，可以得到结论：经过优化后得到黄酮提取的最佳工艺为在乙醇浓度为60%、料液比1∶30，80 ℃水浴震荡1.5 h，超声处理45 min，超声功率140 W，超声温度60 ℃，此时的所得黄酮提取量为58.53 mg/g，超声法具有提取时间短、提取率高、溶剂需要量少等优点[23]。此时黄酮对DPPH·自由基的清除率为91.58%，对ABTS+自由基的清除率为73.71%，对羟自由基的抑制能力为467.91 U/mL，且对蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌具有良好的抑制效果。
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