太瑞斯梭孢壳霉磷脂酶C在玉米胚芽油脱胶中的应用研究

胡婷婷,王 灵,林康森,江正强,杨绍青

(中国农业大学 食品科学与营养工程学院,北京 100083)

摘 要:研究太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)磷脂酶C为核心的玉米胚芽油酶法脱胶工艺。以玉米油磷含量为评价指标,分别研究磷脂酶C添加量、氢氧化钠(NaOH)和柠檬酸体积比、反应温度、反应时间等4个因素对玉米胚芽油酶法脱胶效果的影响。结果表明:玉米胚芽油酶法脱胶最佳工艺条件为磷脂酶C加酶量5 000 U/kg,NaOH和柠檬酸的体积比为4,反应温度为35 ℃,酶解时间为1 h。在该最优条件下,玉米胚芽油磷含量由最初102.7 mg/kg降低至24.0 mg/kg,水解率为76.6%。

关键词:玉米胚芽油;磷脂酶C;酶法脱胶;磷含量;水解率

玉米油富含多种脂肪酸,不饱和脂肪酸含量高达85%左右,其中亚油酸约占55%左右[1-2]。亚油酸作为一种人体自身不能合成的必需脂肪酸,具有降胆固醇、增强心血管机能、软化血管、预防和改善动脉硬化等功效[3]。经压榨离心制得的玉米胚芽油中磷脂含量较高,是毛油中主要的胶溶性杂质,这些杂质的存在不仅会降低油脂的流动性、使用价值和贮藏稳定性,而且在油脂精炼加工中还会导致成品油的质量下降。因此,在油脂精炼过程中需进一步去除磷脂组分[4]

目前,植物油脂脱胶多采用传统脱胶方法,如水化脱胶和酸法脱胶等[5-6]。传统的脱胶方法可以有效地去除水化磷脂,但非水化磷脂很难去除[7]。酶法脱胶是通过添加磷脂酶将毛油中的非水化磷脂转变为水化磷脂,便于利用水化的方法除去[8]。常用于植物油脱胶的酶有磷脂酶 A1(PLA1)、磷脂酶 A2(PLA2)和磷脂酶 C(PLC)。PLA2由于脱胶效果不突出且价格昂贵应用较少,工业应用中多选择PLA1或PLC进行植物油脂脱胶[9-11]。其中PLC具有很多独特的优点,根据侧链基团的不同,磷脂酶C可以分为磷脂酰胆碱特异性磷脂酶 C(PC-PLC)、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)和非特异性磷脂酶C(NPC)。其中,PC-PLC可以特异性水解磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE),但对前者的底物特异性更好;PI-PLC只能特异性水解磷脂酰肌醇(PI),不能水解 PC;NPC则以普通磷脂为底物,可以水解PC、PE、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酸(PA)[11]。PLC脱胶水解产物为有机磷酸酯(磷酸胆碱、磷酸乙醇胺或磷酸肌醇等)及甘油二酯,脱胶过程不产生其它副产物,安全性更高,且脱胶过程中仅需1%~2%的水分,极大减少了废水的产生,对环境污染相对较小,因此更受青睐[12]。目前,已有许多天然或重组PLC应用于不同毛油脱胶,如玉米胚芽油[13]、大豆毛油[14]、菜籽毛油[15]、米糠毛油[16]、山茶毛油[17]和蔬菜毛油[18]等。叶展等[19]利用PLC处理菜籽油,菜籽毛油磷含量由693 mg/kg降低至7.85 mg/kg。Cerminati等[20]将球形芽孢杆菌 PI-PLC和商业PC-PLC复配对大豆毛油进行脱胶,除去了约91%的磷脂。Jiang等[21]使用蜡状芽孢杆菌PLC对山茶毛油脱胶,磷含量降至6.84 mg/kg,脱磷率达到98.2%。同时,部分商业PLC(PLC Purifine®和PLC Lecitase Ultra)也被应用于毛油脱胶,包括大豆毛油和米糠毛油等[22-24],但是关于玉米胚芽油酶法脱胶的报道相对较少[12,23]

本课题组前期从太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)中克隆表达得到一种新型磷脂酶C。该酶应用于大豆毛油脱胶,能完全除去PC和 PI,仅有极少部分的 PE残留[11]。玉米胚芽油磷脂成分包括PC、PI、PA、PE等,主要为PC和PE,含量分别占20%以上。因此,使用对PC和PE底物特异性强的磷脂酶C利于脱胶完全[23]。本研究进一步探究该酶在玉米胚芽油脱胶工艺中的应用效果,优化玉米胚芽油毛油酶法脱胶工艺的主要参数,以期为该酶的后续工业化应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

玉米胚芽油(磷含量 102.7 mg/kg):中粮东海粮油工业张家港有限公司;太瑞斯梭孢壳霉磷脂酶C(TtPLC):中国农业大学酶工程实验室自制;重水 D2O、钼酸钠二水合物、氧化锌、硫酸联氨、脱氧胆酸钠等试剂均为分析纯:上海麦克林生化科技有限公司。

高速台式离心机(TGL 12GB):上海安亭科学仪器厂公司;全温振荡培养箱(HZQ-F160):江苏省太仓市实验设备厂公司;慧泰智能马弗炉(16-12TP):上海慧泰仪器制造有限公司;封闭电炉(TDWYL-12):沧州泰鼎恒业试验仪器有限公司;核磁共振波谱仪(Agilent 500 MHz DD2):美国Agilent公司;水浴恒温振荡器(THZ-82A)、磁力加热搅拌器:江苏金坛市荣华仪器制造有限公司;紫外可见分光光度计(TU 1800 PC):北京普析通用仪器设备有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 磷脂酶C的制备

参照Xiang等[11]方法制备太瑞斯梭孢壳霉磷脂酶 C。从本课题组筛选保藏的嗜热真菌太瑞斯梭孢壳霉Thielavia terrestris CAU709克隆得到磷脂酶C基因,将其在毕赤酵母中进行异源表达。依照Pichia Fermentation Process Guidelines(Version B,053002,Invitrogen)操作方法,在5 L发酵罐中进行高密度发酵制备磷脂酶 C,制备得到的磷脂酶C酶活力为98 970 U/mL。

1.2.2 磷脂酶C活力测定

采用对硝基苯磷脂酰胆碱(p-NPPC)法测定磷脂酶C酶活力:将20 μL适当稀释的酶液加入到96孔板中,再加入180 μL含10 mM p-NPPC的50 mM HEPES pH 6.5缓冲溶液于55 ℃培养箱静置。反应30 min后,使用酶标仪测定410 nm下吸光度值。磷脂酶 C酶活力单位(U)定义为在上述条件下每分钟反应产生1 μmol对硝基苯酚所需的酶量。

1.2.3 玉米胚芽油的酶法脱胶

磷脂酶C应用于玉米胚芽油的脱胶工艺参照Jiang等[25]的方法进行。称取300 g玉米胚芽油于1 L烧杯中,水浴加热至70 ℃,加入0.3 mL的柠檬酸溶液(45 %,w/w),在200 rpm条件下预热处理 20 min。然后冷却至预设温度(25~50 ℃),加入一定量的4% NaOH溶液(w/v,0.3~2.4 mL)调节pH,再加入3 mL蒸馏水和一定量的磷脂酶C纯酶液(0~10 000 U/kg),混合均匀后,在200 rpm摇床中反应(0~4 h)。反应结束后,将油样置于沸水浴中处理10 min终止酶反应,10 000 rpm离心10 min,取上层油样测定磷含量。以加入灭活的酶液处理组作为对照组。

1.2.4 磷含量测定

参照国标GB/T 5537—2008的方法测定磷含量。用坩埚称取3 g油样,加入0.5 g氧化锌在电炉上加热至碳化后,置于马弗炉中575 ℃灼烧2 h至完全灰化。取出坩埚冷却至室温,用10 mL盐酸溶液(50%,v/v)溶解灰分并加热至微沸,5 min后停止加热,待溶解液温度降至室温后过滤注入100 mL容量瓶中,用5 mL热水冲洗坩埚和滤纸3~4次,待滤液冷却至室温后用KOH溶液(50%,w/w)中和至出现混浊,缓慢滴加盐酸溶液(50%,v/v)使氧化锌沉淀全部溶解。最后用水稀释定容。吸取10 mL被测液到50 mL比色管中,加入8 mL硫酸联氨溶液(0.015%,w/v),2 mL 2.5%钼酸钠稀硫酸溶液(V(浓硫酸)∶V(水)=7∶25),加塞振摇3~4次,沸水浴处理10 min,冷却至室温后用水稀释至刻度并充分摇匀,静置10 min。最后用分光光度计测定溶液650 nm下吸光度值。

1.3 数据处理

采用Excel对实验数据进行分析,Origin 2018作图。

2 结果与分析

2.1 反应时间对脱胶效果的影响

在初始条件酶添加量为5 000 U/kg,NaOH和柠檬酸体积比为4,温度为35 ℃时,分别在反应时间为0.5、1、2、3和4 h下进行脱胶实验,以磷含量为指标,考察反应时间对玉米胚芽油脱胶效果的影响。实验结果见表 1,整体来看,随着反应时间的延长,磷含量逐渐下降,其中在0~1 h内油脂磷含量下降显著,反应1~4 h期间,磷含量变化趋于平缓。综合考虑脱胶率和脱胶时间,确定最佳反应时间为1 h。

表1 反应时间对玉米胚芽油脱胶效果的影响
Table 1 Effect of reaction time on the degumming efficiency of crude corn oil

时间/h 0 0.5 1 2 3 4磷含量/(mg/kg) 67.6 38.1 24.0 21.6 21.2 19.1水解率/% 34.2 62.9 76.6 79.0 79.3 81.4

反应时间对磷脂酶 C脱胶效果影响较大。Sampaio等[23]利用商业PLC Purifine®处理玉米胚芽油的最佳反应时间为2 h。Xiang等[11]进行大豆毛油磷脂脱胶时最佳的酶解时间与本研究结果一致。这是由于脱胶过程中磷脂发生凝聚,反应时间过短,磷脂凝聚不完全,脱胶率较低,随着反应时间的延长,脱胶效果提高,反应时间继续增加,脱胶效果不再提升,这是由于反应时间过长容易发生油脂乳化,不利于磷脂的分离[15]。此外,酶活性也会随着反应时间的延长而降低[8]。因此,适宜的反应时间能够提高酶法脱胶的效果。

2.2 NaOH和柠檬酸的体积比对脱胶效果的影响

在初始条件酶添加量为5 000 U/kg,温度为35 ℃,反应时间为 1 h,柠檬酸添加量为 0.1%(v/w)时,通过添加适量体积的NaOH来调节反应体系的pH,分别在NaOH和柠檬酸的体积比为1、2、4、6和8的条件下进行脱胶实验,以磷含量为指标,考察 pH对玉米胚芽油脱胶效果的影响。实验结果见图 1,随着 NaOH和柠檬酸体积比的增加,磷含量呈现先降低后升高的趋势,当NaOH和柠檬酸的体积比为4时,磷含量达到最低点。因此,确定NaOH和柠檬酸的最佳体积比为4。

图1 NaOH和柠檬酸的体积比对玉米胚芽油脱胶效果的影响
Fig.1 Effect of volume ratio of NaOH to citric acid on the degumming efficiency of crude corn oil

不同的酸碱比对玉米胚芽油脱胶效果有很大的影响。Xiang等[11]应用磷脂酶C进行大豆毛油磷脂脱胶最佳酸碱体积比为1 : 2。毛程鑫等[26]用磷脂酶对菜籽油进行脱胶,最佳酸碱体积比为1 : 4.5。这可能是由于pH显著影响酶的活性及酶促反应速度,酶在其最适 pH条件下才能达到最高酶促反应水平,当酶在过低或过高pH条件下,酶结构会受到破坏,酶的活性随之降低甚至失去活性[8,20]。因此,采用适宜的酸碱比能有效提高酶法脱胶的效果。

2.3 温度对脱胶效果的影响

在初始条件酶添加量为5 000 U/kg,NaOH和柠檬酸的体积比为4,酶解时间为1 h时,分别在25、30、35、40、45和 50 ℃下进行脱胶实验,以磷含量为指标,考察温度对玉米胚芽油脱胶效果的影响。实验结果见图 2,随着反应温度的升高,磷含量呈现先降低后升高的趋势,当温度为35 ℃时,磷含量达到最低点。因此,确定最佳反应温度为35 ℃。

图2 温度对玉米胚芽油脱胶效果的影响
Fig.2 Effect of temperature on the degumming efficiency of crude corn oil

温度也是影响酶法脱胶效果的重要因素之一。Qu等[9]进行大豆毛油酶法脱胶时的最佳反应温度为55 ℃。Jiang等[21]进行茶花籽油酶法脱胶的最适反应温度为 53 ℃。温度过低,油脂流动性降低,反应物分子间结合不充分,酶促反应较慢,随着温度的升高,油脂的流动性越好,反应物分子间结合越充分,酶促反应速度越快,但是温度过高会导致酶变性,使酶的活性降低甚至完全不可逆的丧失活性[16,21]。因此,适宜的温度范围能显著提高酶法脱胶效果。

2.4 酶添加量对脱胶效果的影响

在初始条件 NaOH和柠檬酸的体积比为 4,温度为35 ℃,水解时间为1 h时,分别在酶添加量为 0、1 000、2 500、5 000、7 500和 10 000 U/kg的条件下进行脱胶实验,以磷含量为指标,考察酶添加量对玉米胚芽油脱胶效果的影响。实验结果见图3,随着加酶量的增加,磷含量逐渐降低,当加酶量为5 000 U/kg时,磷含量达到最低点。综合考虑,确定PLC脱胶最适加酶量为5 000 U/kg。

图3 酶添加量对玉米胚芽油脱胶效果的影响
Fig.3 Effect of enzyme dosage on the degumming efficiency of crude corn oil

本研究加酶量同Xiang等[11]大豆毛油磷脂脱胶结果一致,但是低于商业PLC Purifine®用于沙棘果油脱胶的酶添加量(12 000 U/kg)。这是由于在底物充足的情况下,酶促反应速度与酶浓度大小成正比。酶浓度越高,酶促反应速度越快,但是反应速度并不会一直随着酶添加量的上升而加快,因此,当酶的浓度达到一定值时,催化速率曲线逐渐趋于平缓,之后再继续增加酶的使用量时,反应速率不再明显变化[8]

综上所述,采用磷脂酶C对玉米胚芽油进行磷脂脱胶的最佳条件为:酸碱比为 4、反应温度为35 ℃、反应时间为1 h、加酶量为5 000 U/kg。在该最优条件下,玉米胚芽油中磷的含量降低到24.0 mg/kg,水解率为76.6%。该酶的脱胶效果优于帝斯曼公司的 DSM磷脂酶 C(商业酶,64.70 mg/kg)[23]和商业 PLC Purifine®(27 mg/kg)[26],稍差于其它几种磷脂酶(表2)。但是从柠檬酸的使用量来看,本研究中的使用量仅为其它脱胶工艺的50%左右(表2)。因此,综合考虑本研究的酶活力、脱胶效果和柠檬酸的用量,重组磷脂酶C(TtPLC)在玉米胚芽油脱胶工业中具有较大的应用潜力。

表2 部分磷脂酶酶法脱胶效率比较
Table 2 Comparison of enzymatic degumming efficiencies of partial phospholipases

来源 酶 水解率/% 含磷量/(mg/Kg) 柠檬酸(w/w)/% 文献Thielavia terrestris PLC 94.2 7.9 45 [11]Bacillus cereus PLC/PLA1 98 6.84 45 [12]Bacillus cereus PLC 97 4.3 50 [15]Bacillus sp.PLC 93 7.34 50 [13]DSM PLC — 64.70 45 [26]T.lanuginosus/F.oxysporum PLA1 92 9.30 45 [19]Novozymes PLC — 8.20 45 [21]DSM PLC 86.5 27.0 45 [23]Novozymes PLA — <10.00 45 [9]Thielavia terrestris PLC 76.6 24.0 20

3 结论

采用自制的太瑞斯梭孢壳霉磷脂酶 C,优化了玉米胚芽油酶法脱胶工艺。得到最佳工艺参数为:NaOH和柠檬酸的体积比为 4、温度为35 ℃、加酶量为5 000 U/kg和水解时间1 h。在最佳条件下,玉米胚芽油脱胶效果显著,磷含量由 102.7 mg/kg降低至 24.0 mg/kg,水解率为76.6%。PLC脱胶不仅安全性高,水解产物为有机磷酸酯及甘油二酯,不产生其它副产品,而且环境友好,脱胶过程用水量少(仅需1%~2%的水分),可显著减少废水排放量。因此太瑞斯梭孢壳霉磷脂酶C在玉米胚芽油酶法脱胶工业中具有潜在的应用价值。

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Application of Phospholipase C from Thielavia terrestris in the Enzymatic Degumming Process of Crude Corn Oil

HU Ting-ting, WANG Ling, LIN Kang-sen, JIANG Zheng-qiang, YANG Shao-qing
(China Agricultural University, College of Food Science and Nutritional Engineering, Beijing 100083, China)

Abstract: The enzymatic degumming process of crude corn oil using phospholipase C from Thielavia terrestris was studied.The key factors affecting the enzymatic degumming efficiency of crude corn oil,including enzyme dosage, volume ratio of NaOH to citric acid, reaction temperature and reaction time, were optimized by a single-factor experiment with the content of phosphorus in corn oil as the evaluation index.The results showed that the optimal enzymatic degumming conditions were: enzyme dosage of 5000 U/kg,volume ratio (NaOH to citric acid) of 4, reaction temperature of 35 ℃ and reaction time of 1 h.Under the optimized conditions, the phosphorus content was reduced from 102.7 mg/kg to 24.0 mg/kg, with a hydrolysis rate of 76.6%.

Key words: crude corn oil; phospholipase C; enzymatic degumming; phosphorus content; hydrolysis rate

中图分类号:TS224.6

文献标识码:A

文章编号:1007-7561(2021)03-0098-06

网络首发时间:2021-04-16 09:11:41

网络首发地址:https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3863.TS.20210415.1844.002.html

DOI: 10.16210/j.cnki.1007-7561.2021.03.013

胡婷婷, 王灵, 林康森, 等.太瑞斯梭孢壳霉磷脂酶C在玉米胚芽油脱胶中的应用研究[J].粮油食品科技, 2021, 29(3): 98-103.

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收稿日期:2020-12-14

基金项目:“十三五”国家重点研发项目(2018YFD0401102);国家自然科学基金(31871744)

Supported by: National Key Research and Development Project of the 13th five-year plan, China (No.2018YFD0401102); National Natural Science Foundation of China (No.31871744)

作者简介:胡婷婷,女,1997年出生,在读硕士生,研究方向为食品酶工程。E-mail:HTT19972623@163.com.

通讯作者:杨绍青,男,1980年出生,教授,研究方向为食品酶工程、脂质合成、乳脂制备。E-mail:ysq@cau.edu.cn.