绿豆营养丰富，是食品工业的重要原料[1]。绿豆在发芽过程中，黄酮和酚类物质被释放出来[2]，增加抗氧化能力，维生素类的物质含量也会大幅增加[3-5]。黄酮类化合物具有抗肿瘤、延缓衰老等作用[6-7]。黄酮和多酚在许多提取物中表现出较好的抗氧化能力[8]。
Swiecam 等[9]在研究发芽时间和光照条件对扁豆豆芽抗氧化化合物和抗氧化能力的影响中发现，在萌发后3～4 d，水杨酸、p-羟基苯甲酸、咖啡酸含量有大幅增加。黄六容[10]等在研究发芽温度对绿豆芽抗氧化成分和抗氧化能力的影响时，发现在 30 ℃下培育绿豆芽能获取最大的产量，但只在 20 ℃下培育绿豆芽才能获取最高的抗氧化性。郭鸽等[11]对4种大豆在发芽过程中的DPPH清除率及总酚和黄酮类物质进行含量测定，分析结果表明总酚含量与抗氧化能力呈现正相关，黄酮类物质含量也有明显的增加。自20世纪60年代初至今，人们不断从绿豆及其萌芽中寻找生物活性物质[12-13]，从绿豆中分离纯化出了许多活性成分，并对其进行功能性分析。
日常生活中，人们受环境、紫外线等各方面影响，体内会催生出大量的自由基，破坏人体抗氧化系统的平衡，威胁人们的健康[14-15]。所以本实验从绿色健康的角度出发，在参考绿豆发芽最适温度，加水量条件后[16]，通过对绿豆萌发过程中抗氧化成分及抗氧化能力变化进行研究，以期为绿豆发芽产品保留丰富的营养及功能活性物质做支持。
1 材料与方法
1.1 原料
绿豆，明绿2号：2018年采摘自黑龙江省齐齐哈尔市泰来县。
1.2 主要设备与试剂
751型分光光度仪：上海仪电分析仪器有限公司；RH-600A型高速多功能粉碎机：浙江荣浩工贸有限公司；CB-A323B型发芽机：九阳股份有限公司。
芦丁，纯度≥94.47%：成都普思生物科技有限公司；没食子酸对照品，纯度≥98%：上海源叶生物科技有限公司；草酸，分析纯：天津市大茂化学试剂厂；福林酚试剂（Folin-Ciocalteau）：sigma公司。
1.3 试验方法
1.3.1 绿豆芽制备
挑选无破损的优质绿豆进行冲洗、浸泡放入豆芽机中，20 ℃恒温培养萌发，制得豆芽备用。
1.3.2 待测样品制备
连续6 d，每天同一时间，准确称取25 g萌发的绿豆芽，置于250 mL烧杯中，搅碎5 min，打浆，取3 g定容于50 mL 60%丙酮水溶液，超声波提取1 h，6 000 g离心10 min，取上清液，分别进行总黄酮、总多酚含量及总还原性、–OH清除率、DPPH清除率及VC含量测定。
1.3.3 总酚含量测定
采用 Folin-Ciocalteau法[17]取上述提取液5 mL，按标准曲线方法测定总酚含量。
测定三组平行数据，计算平均值，按下述公式1计算总酚含量。
式中：X—试样中总酚含量，单位为毫克每克（mg/g）；A—测定用样液中没食子酸的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；m—试样的质量，单位为克（g）；V—试样处理液总体积，单位为毫升（mL）。
1.3.4 黄酮含量测定
参照文献[18]NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法。和略作改进文献[19]取1.3.1节提取液5 mL， 按标准曲线方法测定总酚含量。
测定三组平行数据，计算平均值。根据计算下列公式2进行黄酮含量测定。
式中：X—试样中黄酮的含量（以芦丁计），单位（mg/g或 mg/mL）；A—测定用样液中芦丁的质量，单位为毫克（mg）；m—试样的质量，单位为克（g）；V1—测定用样液体积，单位为毫升（mL）；V2—试样处理液总体积，单位为毫升（mL）。
1.3.5 Vc含量测定
取1.3.1节中的提取液 5 mL，参照国标 GB 5009.86—2016《食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定》中第3法，进行VC含量测定。
1.3.6 总还原能力测定
参照Benzie的方法[20]。取上述提取液5 mL，按标准曲线方法测定总还原能力。
1.3.7 DPPH清除率测定
参考文献[21]配制0.2 mmol/L DPPH无水乙醇溶液，取1.3.1节中的提取液5 mL，测定在517 nm处的吸光值，使用下面公式3对DPPH清除率进行计算。
表1 DPPH自由基清除率测定
Table 1 DPPH free radical clearance rate determination mL
注：–表示试验时不加入该试剂。
0.2 mmol/L DPPH无水乙醇溶液样液 无水乙醇 H2O A1（加样品吸光度） 4.0 4.0 – –A2（空白组吸光度） – 4.0 4.0 –A3（不加样DPPH吸光度） 4.0 – – 4.0
1.3.8 –OH清除率测定
测定方法：取1.3.1节中的提取液5 mL，取3支试管按下表依次添加9 mmol/L的FeSO4，样液和0.5%的H2O2 等试剂，振荡混匀，室温条件下静置10 min后依次加入9 mmol/L的水杨酸–乙醇，振荡混匀。用蒸馏水作对照液，25 ℃水浴30 min，测定在510 nm处的吸光值，使用公式4对–OH清除率进行计算。
表2 –OH清除率测定
Table 2 Determination of –OH clearance rate mL
注：–表示试验时不加入该试剂，单位：mL。
FeSO4 样液 H2O H2O2水杨酸–乙醇A1（加样品后吸光度） 2.0 2.0 – 2.0 2.0 A2（空白组吸光度） 2.0 2.0 2.0 2.0 –A3（不加样–OH吸光度） 2.0 – 2.0 2.0 2.0
1.4 统计分析
应用SPSS 22.0软件处理试验数据，进行分析。
2 结果与分析
2.1 标准曲线
由图1标准曲线显示，标准曲线为Y=4.06X–0.057 8，R2=0.999 0（n=5）。试验结果表明，在0.01～0.18 mg/mL内，没食子酸浓度与吸光值 A有良好的线性关系。根据测定样品的吸光度值带入标准曲线中算出没食子酸标准品浓度，根据计算公式得出各提取液中的总酚含量。由图2标准曲线显示，标准曲线为 Y=24.271X–0.016 1，R2=0.995 8（n=6）。试验结果表明，在0～1 mg/mL范畴内，芦丁含量与吸光值A有良好的线性联系。根据测定样品的吸光值，带入标准曲线中算出芦丁浓度，根据计算公式得出各提取液中黄酮含量。
图1 没食子酸标准曲线
Fig.1 The duofen standard curve
图2 芦丁标准曲线
Fig.2 The luding standard curve
2.2 不同发芽时间抗氧化物质含量与抗氧化能力变化研究
发芽1～6 d总酚、黄酮、Vc含量变化分别见图3～5，由图得出发芽1～6 d总酚和黄酮先增加后降低，Vc含量急剧增加。
图3 发芽过程中总酚含量变化
Fig.3 Changes of total phenol content during germination
图4 发芽过程中黄酮含量变化
Fig.4 Changes of flavonoid content during germination
图5 发芽过程中Vc含量变化
Fig.5 Changes in Vc content during germination
发芽第4 d多酚含量达到最高0.723 7 mg/g，发芽前4 d总酚含量增加28.95%，总体间有明显差异。绿豆在发芽过程中，随着外部形态的变化，为满足发芽需要，其中部分物质通过生化反应转化为酚类物质。当发芽达到一定程度（约第 4 d后），绿豆芽形态变化达到一定程度，液泡膜受到损伤，液泡中酚类物质与多酚氧化酶反应，催化酚类物质氧化成醌，醌再经过聚合作用，不可逆地产生有色物质，引起褐变[22]。从而表现为绿豆发芽过程中多酚含量先增加后降低。
发芽第3 d黄酮含量达到最高0.697 4 mg/g，发芽前3 d黄酮含量增加5.59%。第3 d与第4 d有明显差异，黄酮含量总体间差异较小。绿豆发芽过程中黄酮的含量增加与降低与酶的活性相关，有研究表明[23]黄酮含量与苯丙氨酸解氨酶活性有关。发芽前期（1～3 d），苯丙氨酸解氨酶活性较强，催化部分物质通过生化反应转化为黄酮物质，发芽后期，酶活性降低，黄酮合成趋于平缓，最后降低。
发芽1～6 d，Vc增加了89.48%，总体间存在明显差异。发芽过程中，淀粉水解产生的葡萄糖为Vc的生物合成提供了原料，因而Vc含量大为增加[12]。随着发芽的进程，绿豆内部 Vc得以释放，使Vc功能特性也得以增加。另有研究表明[25]，Vc的增加可以诱导G6PDH酶活性增加酚类物质含量。
发芽1～6 d DPPH清除率、–OH清除率、总还原能力变化见图 6，三种抗氧化能力都表现为先增加后降低。DPPH清除率各数值间显著性差异较大，–OH清除率各数值间均存在显著性差异，总还原能力6个样品之间差异性不大。在发芽第3 d时，DPPH清除率、–OH清除率、总还原能力各指标最高分别为99.28%、97.00%、79.26%，分别提高了4.68%、1.04%、46.76%。第3 d与第6 d相比，各指标均出现较大范围的数值变化。
图6 发芽过程中抗氧化能力变化
Fig.6 Changes in antioxidant capacity during germination
表3 不同发芽时间抗氧化物质含量与抗氧化能力
Table 3 Antioxidant content and antioxidant capacity in different germination times
天数/d 总酚含量/(mg/g) 黄酮含量/(mg/g) 维生素C/(mg/100 g) DPPH清除率/% –OH清除率/% 总还原能力1 0.561 2±0.014 5 0.660 5±0.036 0 0.783 3±0.035 1 94.60±0.47 95.99±0.19b 0.422 0±0.006 0 2 0.534 8±0.000 7 0.677 7±0.051 6 0.863 3±0.051 3 94.91±0.55 95.26±0.09 0.736 6±0.020 8 3 0.673 9±0.001 9 0.697 4±0.012 3 2.063 3±0.041 6 99.28±0.53 97.00±0.13 0.792 6±0.005 0 4 0.723 7±0.001 8 0.520 5±0.007 5 3.716 7±0.035 1 71.54±0.26 91.63±0.24 0.723 0±0.005 5 5 0.526 1±0.001 2 0.409 6±0.026 3 5.730 0±0.045 8 71.51±0.17 71.51±0.17 0.741 6±0.010 4 6 0.525 3±0.001 8 0.362 3±0.008 3 7.450 0±0.117 9 41.40±1.01 65.58±0.04 0.414 0±0.010 2
据相关文献报道[24]，黄酮和酚类物质具有较好的自由基清除能力，是近年来天然抗氧化剂研究的热点之一。因此选用这两种物质含量作为研究绿豆芽最佳食用时间指标，对人体健康吸收有益物质具有重要指导意义。
2.3 绿豆发芽过程中抗氧化成分与抗氧化能力的相关性分析
由表4可知，发芽过程中，总酚与DPPH清除率、–OH清除率之间呈极显著，相关系数分别为0.885和0.768，黄酮与DPPH清除率、–OH清除率相关系数分别为0.553和0.518，说明在发芽过程中主要的抗氧化物质为酚类物质。Gie等[25]研究表明油桃、桃和李中总酚含量与 FRAP和DPPH抗氧化性高度相关，与本研究结果一致。
表4 绿豆发芽过程中抗氧化成分与抗氧化能力的相关性分析
Table 4 Correlation analysis between antioxidant content and antioxidant capacity in green bean germination process %
注：**表示两指标间有极显著相关性（P<0.01）。
指标 DPPH清除率 –OH清除率总酚 0.885** 0.768**黄酮 0.553 0.518
3 结论
绿豆发芽过程中，外部表现为形态发生变化，内部为一些生化反应，这些生化反应会在一段时间内会产生多种对人体有益的物质，酚类和黄酮物质也会相应增加。本研究显示：绿豆经发芽6 d，总酚和黄酮含量先增加后减少，1～4 d总酚含量增加0.162 5 mg/g，提高28.95%。1～3 d黄酮含量增加0.036 9 mg/g，提高5.59%。另外绿豆本身含有较少的维生素物质，发芽后维生素类的物质含量也会大幅增加。1～3 d，DPPH清除率、–OH清除率、总还原能力各指标达到最高分别为99.28%、97.00%、79.26%，分别提高4.68%、1.04%、46.76%。相关性结果表明，抗氧化能力主要与酚类物质有关，因此综合研究结果考虑，建议在绿豆发芽到第4天时食用，此时绿豆芽中含有较高的抗氧化物质和较高的抗氧化能力，对人体最有益，该结论也为绿豆芽食品的开发提供了支持。
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