玉米赤霉烯酮，又名F-2毒素（Zearalenone，简称 ZEN），是一种由镰刀菌属真菌分泌的类雌激素霉菌毒素，最初从发霉玉米中分离得到，普遍存在于玉米、小麦、大米、大麦、燕麦等农作物中，对动物的肝脏等器官造成较大损伤，在动物体内蓄积，引起动物机能异常甚至死亡，给农场造成巨大的影响和经济损失[1-3]。目前，世界各地都对食品、谷物和饲料中的玉米赤霉烯酮的含量做了严格的规范，并制定了相应的玉米赤霉烯酮限量标准。例如欧盟除单独规定玉米外，对小麦、稻谷等供人直接食用的谷物统一规定玉米赤霉烯酮含量不能超过100 μg/kg[4]，我国《GB 2761—2017食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》中明确规定谷物及其制品中玉米赤霉烯酮的残留限量标准为 60 μg/kg[5]。因此，在现如今食品加工和畜牧业生产中，对这种有害人身体健康的真菌毒素的防控就显得尤为重要。
目前，常用的检测粮食中玉米赤霉烯酮的方法有：高效液相色谱法、薄层色谱法、免疫分析方法、液相色谱-质谱法[6-8]等。HPLC检测法作为国标中的第一法，应用最为广泛，虽然该方法灵敏度较高，检测极限低，但此方法检测过程较为复杂，仪器价格昂贵，对操作人员要求较高，操作时间长，不利于检测技术的现场推广应用。ELISA法虽然操作简单、灵敏度高，但不适合现场检测。时间分辨荧光免疫分析测定是一种新一代标记免疫测定技术，根据镧系元素螯合物的长寿命的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，通过同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，具有灵敏度高、快速、灵活，试剂无放射性污染等特点[9-10]，在医疗、环境、食品等领域广泛应用[11-14]。
“舌尖上的安全”需要以方便、快速、准确、易普及的检测技术作为支撑，为更好的发挥快检方法对食品安全监控的基础支撑作用，在传统的胶体金免疫层析半定量技术基础上，对抗体标记物及标记技术进行革新，建立了玉米赤霉烯酮时间分辨免疫层析定量检测法。该方法采用高灵敏度有机荧光纳米微球作为示踪物来标记抗体，提高了标记物的稳定性。微球包裹的铕元素在340 nm紫外光源的照射下发出高强度的荧光，且该荧光寿命长，利用延缓测量时间，待样品基质中自然发生的短寿命荧光（1～10 ns）全部衰变后，再测量稀土元素的特异性荧光，这样可以更多的排除特异本底荧光的干扰，解决了食品检测过程中基质干扰问题，提升了检测的准确度，适合大批样品的测定，在市场上更容易受到青睐[15]。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
玉米赤霉烯酮标准品（纯度≥98%）、碳二亚胺（EDC）、N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）、牛血清白蛋白（BSA）：Sigma-Aldrich公司；ZEN-BSA偶联物、抗玉米赤霉烯酮单抗（纯度≥95%，蛋白浓度18.49 mg/mL，亚型IgG2a，亲和常数9.8×107 L/mol，与ZEN、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇以及玉米赤霉酮的交叉反应率分别为100%、95%、38%、133%、69%和 118%）：江苏省苏微微生物研究有限公司制备；羊抗鼠IgG（10 mg/mL）：上海杰一生物有限公司；铕Eu3+纳米微球（平均粒径200 nm，表面活性基团-COOH，激发365 nm、发射 615 nm）：长沙美牛生物科技有限公司；硝酸纤维素膜CN95、CN140：德国赛多利斯；硝酸纤维素膜Pall90：美国Pall公司；样品垫（SB08）、吸水纸（SX27）、PVC底板（SM31-25）：上海金标生物科技有限公司；玉米、小麦等粮食及其制品：市场购买。
SW-2时间分辨荧光检测仪、ZEN亲和柱：江苏省苏微微生物研究有限公司；GL-21M 高速冷冻离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；HS-3垂直混匀仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；JP-100T超声机：深圳市洁盟清洗设备有限公司；BPG-9240A精密鼓风干燥箱：上海精科实业有限公司；HM3035三维划膜喷金仪、CTS300数控裁条机、ZQ2000自动斩切机：上海金标生物科技有限公司；LC-20AT液相色谱仪：日本岛津公司；色谱柱（HP-C18，4.6*150 mm，5 μm）：美国赛芬科技公司。
1.2 实验方法
1.2.1 抗ZEN单抗的荧光纳米微球标记
将 200 nm时间分辨荧光微球超声分散10 min，取100 μL超声后的微球于2 mL圆底离心管中，加入 900 μL超纯水混匀，并超声分散5 min。分别配制 50 mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）与碳二亚胺（EDC）的乙醇溶液，各取50 μL加入微球悬液，混匀后于垂直混匀仪上活化40 min，15 000 r/min离心30 min，去上清，加入1 mL超纯水，超声5 min使微球分散。于活化后的微球悬液中加入抗ZEN抗体，置于垂直混匀仪上反应2 h，加入BSA使之最终浓度为0.5%，封闭1 h，15 000 r/min离心30 min，去上清，加入1 mL微球保存液超声分散后冷藏备用。
1.2.2 层析膜的制备
将裁成25×300 mm的硝酸纤维素膜，置于三维划膜喷金仪平台上；用含 1.5%蔗糖和 1.5%海藻糖的 PBS（0.01 mol/L/pH7.2）分别溶解ZEN-BSA包被抗原和羊抗鼠IgG至一定浓度，分别放于存储池A和B；以1 μL/cm的划膜量分别将上述溶液划线于 NC膜中央，形成检测线和质控线印迹，两者相距4 mm，其中质控线距离试纸条顶端25 mm；于45 ℃鼓风干燥箱中干燥24 h以上，将层析膜置于铝箔袋中，干燥保存备用。
1.2.3 荧光免疫试纸条的组装
以PVC胶粘板作衬板，将层析膜粘贴在衬板的中央。将样品垫、吸水纸分别粘贴在层析膜的两端，并且两垫之间有1～2 mm的交联。将组装好的试纸条大板用自动斩切机切割成宽4 mm、长60 mm的板条，装于塑料卡壳中，用压壳机压紧。放入带干燥剂的铝箔袋中，连续封口机封口后，常温保存。
1.2.4 反应条件的优化
1.2.4.1 荧光微球标记的抗体和包被抗原浓度的优化 将C线上二抗的浓度固定为0.5 mg/mL，通过改变T线上ZEN-BSA包被抗原和荧光微球标记单抗的浓度，以ZEN标准溶液来考察所制成的试纸条，选择荧光背景弱、荧光峰值高，且 T线与C线的荧光强度之比在 1.0～2.0之间的作为包被抗原与标记抗体的最佳浓度。
1.2.4.2 原材料的选择 选择 Pall 90、Starorius CN140和Starorius CN95三种不同规格的硝酸纤维素膜，按照上述确定的优化条件，用ZEN系列标准品溶液（0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2.5、5、10 ng/mL）点样，观察荧光微球在NC膜上的移动速度、背景是否干净等；反应结束后，采用时间分辨荧光免疫分析仪读数，考察线性范围和相关系数（R2）等，优选出合适的硝酸纤维素膜。
1.2.5 标准曲线的建立
在 1.2.4确定的最佳优化条件下，准确配制0.01 mol/L的 pH为 7.2的磷酸盐缓冲液，加入0.4%的吐温-20，将荧光微球标记的抗ZEN抗体以此分析缓冲液稀释至合适倍数作为样品稀释液。将ZEN的标准品，用50%乙腈-水（体积比）定容配制成410.4 ng/mL的标准储备溶液；再用5%甲醇-样品稀释液（体积比）稀释成0.00、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL 浓度标准工作溶液。分别取100 μL加至试纸条的样品孔中，25 ℃下反应10 min，由低浓度到高浓度进行检测，时间分辨荧光仪检测T线荧光强度与C线荧光强度，计算T/C值。以标准工作溶液浓度的自然对数值（lnC）为横坐标，各浓度标准液的T/C值与0 ng/mL标准液的T/C值的比值所得百分比为纵坐标，建立标准曲线。
1.2.6 样品处理与测定
准确称取5 g粉碎均匀样本，量取25 mL 80%甲醇-水至 50 mL离心管中，混匀，密封；至漩涡混匀器上涡旋提取 2 min，于离心机中4 000 r/min离心5 min，得上清液。测试前将未开封的检测卡及待检样本平衡至 25 ℃；将检测卡平放，用移液器定量吸取50 μL清液加入750 μL样本稀释液中，至漩涡混匀器上混匀，后再吸出100 μL此混合液垂直滴加于加样孔中，开始计时；反应10 min后，将检测卡放入时间分辨荧光免疫层析检测仪中，仪器读数完成后会自动计算出被检样本中的ZEN含量，可选择储存及打印结果。
1.2.7 方法学评价
1.2.7.1 检出限与定量限 取 20组无污染的样品，用玉米赤霉烯酮定量试纸条对其进行检测，以空白样品 20次测定结果的均值加 3倍的标准差，即为检出限；以测定结果的均值加10倍的标准差，即为定量限[16-17]。
1.2.7.2 稳定性 本实验测试试纸条在 1年的保存时间是否有效，根据阿伦尼乌斯公式，将试纸条是置于50 ℃老化23 d未变质，相当于室温1年有效[18-19]。本实验将试纸条置于50 ℃ 42 d加速反应后与未加速的试纸条作对比，考察其稳定性。
1.2.7.3 准确性与重复性 采用空白样品加标回收实验，在小麦、玉米阴性样本中分别加入低、中、高浓度的ZEN标准品，根据SW-2时间分辨荧光检测仪T/C值和标准曲线得出检测浓度。加标回收率=（实测浓度-空白浓度）/加标浓度×100%。
1.2.7.4 与 HPLC法对比验证 选取小麦、玉米等样本共20份，按1.2.6方法处理，同一份样品分别采用ZEN荧光试纸条和IAC-HPLC法进行测定。结果对比分析，进一步验证该方法与国家标准方法的一致性。
1.2.7.5 特异性 配制 1.0 ng/mL的玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素A这4种毒素的标准溶液，用本实验建立的检测方法进行检测。
2 结果与讨论
2.1 反应条件的优化
2.1.1 荧光微球标记单抗浓度及包被抗原划膜质量浓度的确定
不同包被抗原与标记单抗浓度的匹配结果见表 1，标记单抗的量越多，对于不同浓度的ZEN抑制率越差，但单抗用量不可过少，选择合适的荧光强度之比，确定划膜浓度为 0.1 mg/mL，荧光微球标记的单抗终浓度为0.02 mg/mL。
表1 包被抗原与标记单抗浓度的确定
Table 1 Determination of the concentration of antigens and labeled antibodies
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2.1.2 原材料确定
三种硝酸纤维素膜对显色和线性的检测结果见表2。结果显示，赛多利斯CN95膜的显色速度较快，背景清晰干净，且线性良好。从表3三种硝酸纤维素膜对荧光强度和 T/C的影响结果来看，在同样的 T线包被浓度下，赛多利斯 CN95膜所测出的荧光强度较其他两种膜要高。因此，从节约原材料成本方面等方面综合考虑，最终选择赛多利斯CN95膜作为本研究最佳的NC膜材料。
表2 三种规格硝酸纤维素膜对显色和线性的影响
Table 2 Effect of three types of nitrocellulose films on color development and linearity
膜规格 显色速度/s 层析卡背景 线性范围/(μg/L)线性相关系数(R2)Pall 90 48 干净，无荧光残留 0.1～10 0.976 4 Starorius CN140 53 干净，无荧光残留 0.1～10 0.952 9 Starorius CN95 45 干净，无荧光残留 0.1～10 0.993 3
表3 三种规格硝酸纤维素膜对荧光强度和T/C值的影响
Table 3 Effects of three types of nitrocellulose films on fluorescence intensity and T/C value
膜规格 Pall 90 Starorius CN140 Starorius CN95 T值 17 349 18 600 17 987 27 181 21 962 24 811 46 825 55 976 40 042 C值 56 914 48 951 57 300 42 332 31 478 38 037 28 829 32 620 24 236 T/C 0.305 0.380 0.314 0.642 0.698 0.653 1.624 1.716 1.652
2.2 标准曲线的建立
由图1可以发现横坐标采用的是浓度的自然对数，但是通过绘制得到的是平滑的S曲线，这与免疫竞争得到的曲线是一致的[20]；同时在0.1～5 ng/mL浓度范围内，有效剂量值即抑制率（以下采用 B/B0表示）在 92%～19%，线性回归相关系数 R2达 0.993 3，直线方程 y = -0.183 6x +0.475 7。由此，确定标准曲线的线性范围，并以此作为以下实验的线性浓度。
图1 不同浓度（0.05～10 ng/mL）平滑曲线
Fig.1 Smooth curve of different concentrations (0.05～10 ng/mL)
2.3 检测限和定量限的确定
测定结果和计算结果见表 4。方法的检出限为 10.05 μg/kg、定量限为 20.13 μg/kg。
表4 方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ）（n=20）
Table 4 The limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) of wheat flour
测定次数平均值x/(μg/kg)标准偏差S检出限LOD/(μg/kg)定量限LOQ/(μg/kg)20 5.73 1.44 10.05 20.13
2.4 稳定性分析
检测结果如图 2所示，试纸条在 50 ℃存放28 d时，T/C值无明显下降，在35 d之后，T/C值略有下降，说明试纸条在常温下1年的稳定性良好。
图2 试纸条稳定性分析
Fig.2 Stability analysis of test strips
2.5 准确性和重复性分析
根据国家限量标准，设定3个浓度，涵盖低、中、高浓度的加标回收测定。分别对阴性小麦及玉米进行不同水平的ZEN加标，加标浓度分别为20、60及120 μg/kg，用ZEN荧光试纸条重复测定5次，计算平均回收率在93.45%～112.2%之间，5次重复的变异系数在6.81%～12.31%之间（见表5）。
表5 小麦、玉米不同浓度加标回收率（n=5）
Table 5 The recovery rate of different concentrations of wheat and corn (n=5)
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2.6 与HPLC法对比验证结果
将两种方法对 20份典型样品的检测结果进行线性回归分析，结果如图 3，两种方法的线性回归系数 R2=0.959 2，结果高度相关，具有良好的一致性。
图3 HPLC与试纸条测定样品中ZEN的相关性
Fig.3 Correlation between HPLC and test strips in the determination of ZEN in samples
2.7 试纸条的特异性
用ZEN荧光试纸条分别测定1.0 ng/mL的玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素A这4种毒素的标准品，最后计算得出与玉米赤霉酮与黄曲霉毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素A基本无交叉反应，说明该产品特异性良好。
3 结论
本研究方法基于抗原抗体的特异性免疫反应原理，采用高灵敏度有机荧光微球作为示踪物这一新方法来标记抗体，从市场需求出发，创新性地研制出玉米赤霉烯酮时间分辨荧光免疫层析卡为核心产品的霉菌毒素快速检测系统，具有小型、便携、智能化等优点，形成了易于推广和应用的霉菌毒素快速检测系统用户终端。
本实验研制的玉米赤霉烯酮快速定量免疫试纸条，采用铕纳米微球作为荧光探针，标记抗ZEN的单抗，通过竞争抑制建立免疫层析定量方法。试纸条的灵敏度为0.1 ng/mL，检出限为10.05 μg/kg，定量限为20.13 μg/kg，显著高于胶体金方法和酶联免疫法的灵敏度，与一般的ELISA方法相比，试纸条的操作更加简便，所需时间更短，可为实验人员减轻负担。其次，其他方法学参数评价结果表明，样品的加标回收率在 93.45%～112.2%之间，对于同一个样品的5次重复的变异系数均小于15%，采用IAC-HPLC法和试纸条同时检测小麦、玉米等20份样品，结果表明这两种方法具有良好的相关性。其准确性和可靠性基本满足了绝大多数粮食及其制品中玉米赤霉烯酮的检测。
时间分辨荧光试纸条操作简单，简单样本只需甲醇提取处理即可测定，从提样至得出结果只需25 min；配套小型经济、便于携带的荧光分析仪，不仅降低了企业的检测成本，还有效提升了企业产品质量的检测能力，同时也为政府职能部门提供了快速、有效、易于普及的检测技术和手段，尤其适合基层单位，便于大量样本的筛选。因此，具有非常好的推广应用价值，有利于保障食品的质量安全和消费者的健康。
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