表1 主要成分分析
成分含量 乳酸/（mg/100 mL）707.0±47.3 柠檬酸/（g/100 mL）25.0±0.0 总糖/%2.209 8±0.002 还原糖/%0.035±0.002 粗蛋白/%1.13±0.25 K+/（mg/L）2 533.5±0.0 Mn2+/（mg/ L）103.0±0.0 Mg2+/（mg/ L）512.0±0.0
韩 伟，王大为，李晓敏，张晓琳
（国家粮食局科学研究院，北京 100037）
摘 要： 利用乳酸菌生产过程中的发酵废液制作酸化剂，以期将高浓度有机废液经济地、高效地转化为资源性产品。收集植物乳杆菌（ATCC 14917）发酵后产生的废液制成酸化剂，检测总糖、还原糖、粗蛋白、氨基酸及金属离子等指标，并按一定比例加入到仔猪饮水中，检测分析动物的生长性能、肠道菌群结构及免疫性能。结果表明：该发酵废液制成的酸化剂（pH 3.0~3.5）主要成分如下：总糖含量2.2%，还原糖含量0.035%，粗蛋白含量1.13%，氨基酸含量1.09%。将酸化剂以0.5%的添加量加入仔猪的饮水系统中，饲喂周期35 d，与对照组相比，酸化剂组仔猪的平均日增重提高13.8%（ P <0.05），料肉比降低18.1%（ P <0.05），腹泻率降低22.9%（ P <0.05）；粪便中变形菌门菌群和螺旋菌门菌群显著降低，饲喂至第18 d时，乳杆菌属的相对丰度小幅增加；血清中HSP-40、IgA、IgM含量有不同程度提高。乳酸菌发酵废液制成的酸化剂，展现了良好的饲用价值，在环境保护和废液资源化利用方面应用前景广阔。
关键词： 发酵废液；乳酸菌；酸化剂；肠道菌群；免疫性能
发酵废液具有浓度高、成分复杂、有毒有害物质多，处理工艺复杂、处理成本高等特点 [1] 。随着国民经济的稳健发展，农业、医疗、食品相关的发酵工业规模持续增长，如抗生素 [2] 、谷氨酸 [3] 、维生素 [4] 、酒精 [5] 、 b -环糊精 [6] 等的生产，在满足人民日益增长的物质需求的同时，也带来了大量的发酵废液。很多学者都在探索发酵废液污染防治新机制。例如，薛海涛 [7] 通过电渗析技术利用乳酸链球菌发酵废液制备乳酸钙和乳酸钠保湿剂，同时利用电渗析产生的有机废水发酵生产乳酸；武玉强 [8] 等利用芽孢杆菌发酵废液培养小球藻。处理好发酵废液，推进工业水循环利用，可加快产业升级改造步伐，实现环境效益、经济效益与社会效益多赢。
酸化剂具有调控动物肠道微生物平衡、增殖有益菌、抑制有害菌、降低肠道pH值、提高消化道酶的活性、提高营养物质消化率、提高动物机体免疫力及避免抗药性与药物残留等方面的作用和功能 [9-10] 。发酵废液制成液态酸化剂，不但利用了废液中的有机质，节约了水资源，而且低成本地形成饲用抗生素的替代产品，实现发酵废液的有效利用。
本实验利用植物乳杆菌发酵废液制成酸化剂，在明确其主要营养成分的同时，探讨该酸化剂对断奶仔猪生长性能和肠道健康的影响，为其在生产实践中的应用提供参考。
植物乳杆菌（ATCC 14917）：购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。ELISA试剂盒：购自武汉默沙克生物科技有限公司，检测热休克蛋 白-40（HSP-40）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）。
种子及发酵培养基：葡萄糖20 g，玉米浆10 g，酵母浸膏5 g，MgSO 4 ·7H 2 O 1.2 g，MnSO 4 ·H 2 O 0.25 g，TWEEN-80 0.5 mL，豆油0.05 g，蒸馏水1 000 mL，用1 mol/L NaOH调节pH为7.0，115 ℃灭菌30 min。
柠檬酸、葡萄糖、玉米浆、酵母浸膏、豆油为食品级，其余药品或试剂均为国产分析纯。
1.2.1 发酵废液取得与酸化剂制备
发酵废液取得：取斜面菌种一环接于种子培养基摇瓶中，37 ℃、150 r/min摇床培养8 h后，按0.5 %比例转接至另一同样液体培养基摇瓶中，37 ℃、180 r /min 摇床培养8 h，再按1.5 %比例转接至（通氧）发酵罐培养12 h，得到发酵液。发酵液经管式离心（15 000 r/min，30 min），实现固液分离，其中的液体部分即为发酵废液。
酸化剂制备：将称量好的柠檬酸按1∶24的比例加入到发酵废液中，混合均匀，pH控制在3.0~3.5，密封备用。
1.2.2 成分指标检测
乳酸，利用生化分析仪（SBA-40C型）检测；总糖，参照GB/T 15037—2006 [11] 方法；还原糖，参照GB/T 5009.7—2016 [12] 方法；粗蛋白，参照GB/T 6432—1994 [13] 方法；K + 、Mn 2+ 、Mg 2+ ，参照GB/T 14609—2008 [14] 方法；氨基酸，参照GB/T 18246—2000 [15] 方法。
1.2.3 动物实验
实验动物：选用体重基本一致的35日龄健康仔猪100头，按性别和体重相近原则随机分成2个处理，每个处理5个重复，每个重复10头，每个重复单舍饲养。日粮组成和营养水平参照NRC（1994）。
实验设计：处理1为对照组，日粮中添加抗生素（75 mg/kg金霉素）；处理2为酸化剂组，饮水中添加0.5%的1.2.1中的酸化剂。
样品与数据收集：留取第0 d、第18 d、第36 d粪便和血清样品，备用。同时，分别记录仔猪初重，及第18 d、第36 d的饲料消耗量与体重，观察并统计仔猪腹泻状况。
1.2.4 肠道菌群多样性分析
使用DNA提取试剂盒（Omega Bio-tek Inc., Norcross, GA, USA）提取粪便中细菌DNA，并PCR扩增其V3-V4区共467 bp的片段。引物：338F 5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)-3’；806R 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。PCR体系：20 µL，4 μL的5×FastPfu Buffer，2 μL的2.5 mM dNTPs，1.6 μL引物（5 μM），0.4 μL的FastPfu聚合酶及无菌超纯水。PCR产物送至北京微生太科技有限公司进行高通量测序（Illumina Miseq平台）。测序和分析方法参照参考文献 [16-21] 。
1.2.5 免疫性能分析
使用1.1中所述ELISA试剂盒，检测第0 d、第18 d、第36 d仔猪血清样品中的Ig A、Ig G、Ig M、HSP-40。
1.2.6 数据处理
实验数据以Mean±SD表示，采用SPSS16.0进行数据拟合及方差检验。
植物乳杆菌（ATCC 14917）在发酵罐培养 12 h，此时发酵液中活菌数达到4×10 9 CFU/m，经高速离心实现固液分离。向其中的液体部分（即发酵废液）加入柠檬酸，制成本实验中的酸化剂，主要成分分析见表1~表2。
表1 主要成分分析
由表1~表2可见，除固定添加浓度至25.0 g/ 100 mL的柠檬酸外，由于植物乳杆菌同型乳酸发酵产生L-乳酸的缘故，酸化剂含有707 mg/100 mL的L-乳酸。相比单纯酸化剂，液体中有机营养含量高，总糖占2.2%，其中还原糖含量为0.035%；粗蛋白占1.13%，其中氨基酸含量为1.09%。此外，主要金属离子为K + 、Mg 2+ 、Mn 2+ ，浓度分别为2 533.5 mg/L、512.0 mg/L与103.0 mg/L。
表2 氨基酸组成与含量 %
发酵废液制成的酸化剂，按0.5%的添加量加入到断奶仔猪的饮水系统，对仔猪生长性能的影响见表3。由表3可见，在饲养周期内，酸化剂组与对照组相比，平均日增重提高13.8%（ P <0.05），料肉比降低18.1%（ P <0.05）。
表3 添加酸化剂对仔猪生长性能的影响
注：同列肩标不同表示数据间差异显著（ P <0.05）。
发酵废液制成的酸化剂对仔猪腹泻和死亡的影响结果见表4。由表4可见，在饲养周期内，酸化剂组与对照组相比，腹泻率降低22.9%（ P <0.05），死亡率从0.08%下降至0。
表4 添加酸化剂对仔猪腹泻的影响
注：同列肩标不同表示数据间差异显著（ P <0.05）。
收集两个饲喂处理组在不同生长时间点的粪便，利用高通量测序技术检测16S rRNA 基因，分析菌群的高分辨信息（包括定性与丰度数据），结果见图1~图2。
由图1可见，在“门”分类水平上，酸化剂组与对照组相比，厚壁菌门（ Firmicutes ）、拟杆菌门（ Bacteroidetes ）、放线菌门（ Actinobacteria ）、变形菌门（ Proteobacteria ）、螺旋菌门（ Spirochaetae ）、无壁菌门（ Tenericutes ）代表着样品中大多数菌群，占比98%以上。同时，两组间各物种的丰度发生了明显的变化。与对照组相比，酸化剂组中变形菌门菌群和螺旋菌门菌群显著降低。
图1 组间物种（门水平）组成（a）及差异显著性检验（b）
注： Firmicutes ，厚壁菌门； Bacteroidetes ，拟杆菌门； Actinobacteria ，放线菌门； Proteobacteria ，变形菌门； Spirochaetae ，螺旋菌门； Tenericutes ，无壁菌门； Cyanobacteria ，蓝藻门； Chlamydiae ，衣原体门； Saccharibacteria ，糖菌门； Verrucomicrobia ，疣微菌门； Elusimicrobia ，迷踪菌门； unclassified_k_norank ，未确定分类菌群。*表示0.01< P ≤0.05；**表示0.001< P ≤0.01。
由图2可见，在“属”分类水平上，无论对照组还是酸化剂组，随着时间的变化仔猪菌群结构也在发生着改变。从第0 d到第36 d，罕见小球菌属（ Subdoligranulum ）、乳杆菌属（ Lactobacillales ）、普氏菌属（ Prevotella ）等始终为优势菌群且相对丰度变化不大( P >0.05)，而双歧杆菌属（ Bifidobacterium ）、月形单胞菌属（ Selenomonas ）、小杆菌属（ Dialister ）、韦荣球菌属（ Erysipelotrichaceae ）、光岗菌属（ Mitsuokella ）及某些乳杆菌（unclassified- Lactobacillales ）等相对丰度显著增加（ P <0.05）。另外，与对照组相比，在第18 d时，酸化剂组的乳杆菌属的相对丰度小幅增加（ P <0.05）。
利用酶联免疫法分析，检测发酵废液制得的酸化剂对仔猪血清中HSP-40、IgA、IgG、IgM等的影响，结果见表5。
由表5可见，与对照组相比，添加酸化剂喂养的仔猪血清中HSP-40、IgA、IgM含量显著提高（ P <0.05），而IgG无显著性改变（ P >0.05）。
图2 肠道菌群组成热图（属水平）
注：G5_0d_3~G1_18d_2为样本名称，其中G1为对照组，G5为酸化剂组，0 d、18 d、36 d表示取样时间，_1、_2、_3表示不同的重复，右侧为物种“属”名称，上侧为样本聚类树。颜色深浅代表物种丰度的高低。
表5 免疫性能分析
注：同列肩标不同表示同一测量时间的数据间差异显著（ P <0.05）。
乳酸菌作为一类重要益生菌，在健康产业迅速发展中，其工业产值与市场规模日益增长。与此同时，废液产生量巨大，污染巨大，生产1 kg乳酸菌大约会产生50~100 L的发酵废液，化学需氧量（COD）一般在3 000~ 5 000 mg/L之间。如何实现发酵废液的有效利用，是乳酸菌发酵行业适应时代发展过程中需要解决的关键问题之一。
本研究将植物乳杆菌发酵后产生的废液，制成包含柠檬酸和乳酸的酸化剂，分析了主要营养成分及含量，包括（除25.0 g/100 mL的柠檬酸外）707 mg/100 mL的L-乳酸、2.2%的总糖，0.035%的还原糖，1.13%的粗蛋白，1.09%的氨基酸，K + 、Mg 2+ 、Mn 2+ 浓度分别为2 533.5 mg/L、512.0 mg/L与103.0 mg/L。再将该酸化剂按一定比例加入到仔猪饮水中，经过35 d的饲养周期，仔猪的平均日增重提高13.8%（ P <0.05），料肉比降低18.1%（ P <0.05），腹泻率降低22.9%（ P <0.05），死亡率从0.08%下降至0；粪便中变形菌门菌群和螺旋菌门菌群显著降低，饲养至第18 d时，乳杆菌属的相对丰度小幅增加（ P <0.05）；血清中HSP-40、IgA、IgM含量有不同程度提高（ P <0.05）。综上所述，乳酸菌发酵废液制得的酸化剂可显著提高仔猪的生长性能和免疫性能。
在今后的研究中，有两个问题需要深入探讨：本研究中仅添加了一种有机酸，需要进一步探索复合型酸化剂组合配方、使用剂量与功效；实现废水利用的同时，发酵废液体积和质量没有减少，物流成本大，作为饲用酸化剂时需充分研究其使用半径与经济效益的平衡点。
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Study on the preparation of acidifying agent from lactic acid bacteria fermented wastewater and its application effects
HAN Wei, WANG Da-wei, LI Xiao-min, ZHANG Xiao-lin
(Academy of State Administration of Grain, Beijing 100037)
Abstract: The fermented wastewater in the process of producing lactic acid bacteria was utilized to make the acidifying agent in order to convert the high concentration organic wastewater economically and efficiently into a resource product.The waste liquid produced by Lactobacillus plantarum (ATCC 14917) fermentation was collected, and the acidifying agent was prepared. The indexes, including total sugar, reducing sugar, crude protein, amino acid and metal ion, were detected. The acidifying agent added to drinking water at a certain proportion for piglets, whose growth, intestinal microflora and immune function of were analyzed. The results showed that the main ingredients in the acidifying agent (pH 3.0~3.5) were 2.2% total sugar, 0.035% reducing sugar, 1.13% crude protein and 1.09% amino acids. The acidifying agent was mixed into the piglets' drinking water system by 0.5% feeding for 35 d. Compared with the control group, in acidifying agent group, the daily weight gain of piglets increased significantly by 13.8% ( P <0.05), the ratio of feed to meat and diarrhea rate decreased by 18.1% and 22.9% ( P <0.05), respectively. The flora of proteobacteria and spirochaetae decreased significantly in the feces, and the relative abundance of lactobacillus . sp increased slightly after feeding for 18 d. The levels of HSP-40, IgA and IgM were significantly improved in the serum. The acidifying agent shows good feeding value made from the wastewater of lactic acid bacteria, and has a bright future in environmental protection and utilization of wastewater.
Key words: fermented wastewater; lactic acid bacteria; acidifying agent; intestinal microflora; immune performance
DOI: 10.16210/j.cnki.1007-7561.2018.05.013
中图分类号： TS 201.3; TQ 920.9
文献标识码： A
文章编号： 1007-7561(2018)05-0070-06
收稿日期： 2018-03-23
基金项目： 北京市农业科技资金项目（20170157）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金课题（ZX1712）
作者简介： 韩伟，1983年出生，男，副研究员.
通讯作者： 张晓琳，1975年出生，女，研究员.