表1 4因素3水平的正交实验设计
雷海容 1 ，张枫燃 2 ，梁洪祥 1
（1. 长春大学 科技开发研究中心，吉林 长春 130022; 2. 延边大学，吉林 延吉 133002）
摘 要： 将大豆异黄酮（大豆染料木素与染料木苷占40%）添加到巧克力配料中，通过单因素实验及正交实验，优化大豆异黄酮巧克力制备工艺。确定更年期女性每人摄入大豆染料木素与染料木苷总量30 mg/d，为具有类雌激素效应的有效摄入量。通过优化，得到最佳工艺为：精磨温度为45 ℃、精磨时间8 h、精炼温度80 ℃、精炼时间72 h、调温时间30 min，大豆异黄酮添加量为1.25 %、可可液块添加量为9 %、可可脂添加量为18 %、蔗糖添加量为35 %、奶粉添加量为8 %、食用植物油添加量为28 %、卵磷脂添加量为0.5 %、香料添加量为0.25 %。最佳工艺条件下制备的大豆异黄酮巧克力对更年期综合症具有一定改善功效。
关键词： 大豆异黄酮；巧克力；类雌激素效应；更年期综合症
大豆异黄酮具有弱雌激素活性 [1] ，可降低妇女绝经前乳腺癌的发生率 [2] 及男性患前列腺癌的风险 [3] 。大豆异黄酮还可调节细胞胆固醇代谢 [4] ，预防和治疗动脉粥样硬化 [5] ，增加老年妇女骨密度，有效预防和治疗骨质疏松症 [6-8] 。
大豆异黄酮与女性雌二醇结构相似，是天然植物雌激素 [9] ，包括12种异构体 [10] ，其中大豆染料木素是具有类雌激素效应的成分，而大豆染料木苷可在人体内经酶反应形成大豆染料木素，因此大豆染料木苷与染料木素同视为具有类雌激素效应的成分 [11] 。
更年期综合症产生的原因是由于雌激素分泌减少、卵巢功能衰退而分泌过多的垂体促性腺激素。其症状主要包括月经紊乱、烘热汗出、脸红潮热、健忘失眠、焦虑易怒、皮肤老化、腰痛、心悸、抑郁、乏力等 [12] 。目前，我国居民来自工作与家庭的压力日益加大，导致更年期综合症患者年龄年轻化，症状加重，引起越来越多的人们重视 [13] 。本文研究了大豆异黄酮具有类雌激素效应的有效摄入量，将其添加到巧克力中制备大豆异黄酮的保健食品，可用于减轻因缺乏雌激素而引起的更年期综合症 [14-15] ，从而提高更年期妇女的健康水平及生活质量。
大豆异黄酮（大豆染料木素与染料木苷占40%）：长春吉科生物食品有限公司；可可液块、可可脂：无锡上可食品有限公司；检测试剂盒：德国罗氏Cobase 41l血清雌二醇试剂盒；大豆染料木素、大豆染料木苷、乙腈(色谱纯)、二甲基亚砜（色谱纯）：美国Sigma公司；蔗糖、奶粉、食用植物油、卵磷脂、香料：市售。其他试剂均为国产分析纯。
德国罗氏Cobase 41l全自动化学发光仪；TQMJ250小型巧克力精炼机：苏州市天方机构有限公司；QYJ 型精磨机与QTPMini型调温机：苏州市金鹰机械设备有限公司；塑封包装机：无锡友承机械制造有限公司；巧克力模具：阳江市天林实业有限公司；LC-20A型高效液相色谱仪：日本岛津公司；CSB-SY型超声波振荡器：金坛市华城润华实验仪器厂；FA2204B型电子天平：上海精密科学仪器有限公司；Mini-15K微型高速离心机：杭州奥盛仪器有限公司；J-26XP型高速冷冻离心机：美国BECKMAN COULTER公司； - 30 ℃低温冰箱：上海科菱威生物科技有限公司。
1.3.1 采用电化学发光法检测妇女血清中雌二醇（E 2 ）水平 [16]
选择身体健康并具有更年期症状的45~55 岁女性，随机分成正常对照组、低摄入量组、中摄 入量组、高摄入量组及阳性对照组。正常对照组不服用大豆异黄酮，低、中、高摄入量组每日分别服用不同量的大豆异黄酮，阳性对照组按市售大豆异黄酮保健食品说明书服用。五组连续服用30 d，待末次服用后隔夜禁食12 h，清晨采肘静脉血3 mL至采血管中，离心取血清置于 - 30 ℃冰箱保存待检。严格按试剂盒说明书要求检测血清E 2 水平，进行自身对照。应用SPSS 17.0软件进行统计，采用Student-t检验处理。
1.3.2 采用高效液相色谱法检测大豆异黄酮巧克力中大豆染料木素与染料木苷总量 [17]
随机取10块样品，将每块巧克力研磨至粉末，并编号1~10，分别取1.0 g巧克力粉末至100 mL容量瓶中，再加入甲醇溶液，经超声波振荡器振荡后加入甲醇溶液定容，离心后再经0.45 μm孔径的微孔滤膜过滤，所得滤液用于高效液相色谱分析。采用日本岛津高效液相色谱系统，在一定条件下，绘制出标准曲线。通过标准曲线，计算得到每块巧克力中的大豆染料木素与染料木苷的总量。
1.3.3 大豆异黄酮巧克力对更年期综合症影响的定性实验方法
选择10位具有更年期症状的女性，每人每日标准化服用1块大豆异黄酮巧克力，连续服用30 d，记录服用巧克力前后的自我感觉描述，进行自身对照。
1.3.4 大豆异黄酮巧克力的制备方法
工艺流程：
卵磷脂、香料
↓
配料→混合精磨→精炼→调温→浇模→冷冻→脱模→检测→包装→成品。
巧克力配料的基础配方及实验用量范围：可可液块8%~12%、可可脂14%~20%、蔗糖30%~38%、奶粉6%~12%、食用植物油22%~30%、卵磷脂0.4%~0.6%、香料0.2%~0.3%。
制备方法及工艺要点：固态的可可液块及可可脂融化成液态后，将各物料按照不同添加量混合送入精磨机中，在浆料送入精炼机前投入卵磷脂及香料；由于异黄酮可溶于80 ℃以上热水 [18] ，因此精炼温度选择80 ℃；将精炼后的浆料送入调温机中；巧克力浆料经调温后浇入模具内，冷却至室温后冷冻脱模。模具为长方块状，规格为每块重6 g。随机取异黄酮巧克力10块，每块含大豆染料木素与染料木苷总量为具有类雌激素效应的有效摄入量±5 mg，视为合格产品。将检测后的巧克力塑封包装，即为成品大豆异黄酮巧克力。
1.3.5 单因素实验及正交实验设计
根据预实验结果，卵磷脂及香料的添加量分别为0.5%、0.25%，由于其数值非常小，不影响成品品质，选择影响大豆异黄酮巧克力感官品质的主要因素进行单因素实验及正交实验设计。本实验分别对制备巧克力的各因素工艺条件进行了考察。
在大豆异黄酮添加量1.25%、可可液块添加量8%、可可脂添加量14%、蔗糖添加量31%、奶粉添加量7%、食用植物油添加量24%、卵磷脂添加量0.5%、香料添加量0.25%的条件下，选取精磨温度、精磨时间、精炼时间、调温时间进行单因素实验。根据单因素实验结果，以大豆异黄酮巧克力的感官评价为考察指标，按表1进行4因素3水平的正交实验。
在精磨温度35 ℃、精磨时间6 h、精炼温度80 ℃、精炼时间36 h、调温时间20 min的条件下，选取可可液块、可可脂、蔗糖、奶粉及食用植物油的不同添加量进行单因素实验。根据单因素实验结果，以大豆异黄酮巧克力的感官评价为考察指标，按表2进行5因素4水平的正交实验。
表1 4因素3水平的正交实验设计
表2 5因素4水平的正交实验设计
1.3.6 大豆异黄酮巧克力的感官评价
以大豆异黄酮巧克力色泽 [19] 、风味、余味 [20] 及质地 [21] 为评定指标。通过经培训过的8位专家评价员，独立进行专家问卷打分，满分为100分，有差距的按感官评价标准扣分，取平均分为感官评分值，最后统计得出综合评分。大豆异黄酮巧克力的感官评价标准见表3。
表3 大豆异黄酮巧克力的感官评价标准
我国大豆异黄酮保健食品中的大豆异黄酮每人摄入量均≤126 mg/d [22] ，因此本文以每人125 mg/d为摄入大豆异黄酮的上限。受试女性的血清雌二醇水平如表4所示。
由表4可知，更年期妇女服用大豆异黄酮前后的血清E 2 水平增加值的顺序为：高摄入量组 > 中摄入量组 > 阳性对照组 > 低摄入量组 > 正常对照组。低摄入量组的血清E 2 水平与正常对照组相比升高不明显；中摄入量组与高摄入量组的血清E 2 水平平均增加值为22.60±6.53 pg/mL，明显高于阳性对照组，且经T检验差异显著。从经济方面考虑，本文采用大豆异黄酮添加量75 mg/d，因每块巧克力重量为6 g，则大豆异黄酮添加量为1.25%，即每块巧克力添加30 mg大豆染料木素与染料木苷，同时确定具有类雌激素效应的有效摄入量为30 mg。
表4 服用大豆异黄酮前后血清E 2 水平
注：阳性对照组分别服用4种市售大豆异黄酮保健食品。阳性对照组Ⅰ：浙江产大豆异黄酮维E软胶囊；阳性对照组Ⅱ：山东产大豆异黄酮维E软胶囊；阳性对照组Ⅲ：黑龙江产大豆异黄酮片剂；阳性对照组Ⅳ：西安产大豆异黄酮颗粒冲剂。
2.2.1 精磨温度对大豆异黄酮巧克力感官品质的影响
精磨温度指巧克力浆料中心的温度。根据预实验结果，在固定精磨时间6 h、精炼温度80 ℃、精炼时间36 h、调温时间20 min的条件下，选取精磨温度分别为35、40、45、50、55 ℃，按制备方法进行实验，结果见图1。
图1 精磨温度对大豆异黄酮巧克力感官品质的影响
由图1可知，在固定其他工艺条件时，随着精磨温度的增加，异黄酮巧克力感官评分先逐渐上升，在巧克力浆料中心温度为45 ℃时，异黄酮巧克力口感及质地最佳，继续增加精磨温度，巧克力浆料变稠，成品巧克力过硬，影响品质。
2.2.2 精磨时间对大豆异黄酮巧克力感官品质的影响
根据预实验结果，在固定精磨温度35 ℃、精炼温度80 ℃、精炼时间36 h、调温时间20 min的条件下，选取精磨时间分别为6、7、8、9、10 h，按制备方法进行实验，结果见图2。
图2 精磨时间对大豆异黄酮巧克力感官品质的影响
由图2可知，精磨时间不足，巧克力口感粗糙；当精磨时间为8 h时，异黄酮巧克力口感细腻，品质最佳；精磨时间过长，巧克力浆料流动性不良，影响巧克力品质。
2.2.3 精炼时间对大豆异黄酮巧克力感官品质的影响
根据预实验结果，在固定精磨温度35 ℃、精磨时间6 h、精炼温度80 ℃、调温时间20 min条件下，选取精炼时间分别为36、45、54、63、72 h，按制备方法进行实验，结果见图3。
图3 精炼时间对大豆异黄酮巧克力感官品质的影响
精炼过程对巧克力品质起着重要的作用，长时间精炼，可使大豆染料木素与染料木苷均匀地分布于巧克力浆料中。由图3可知，随着精炼时间的增加，异黄酮巧克力感官评分随之增加，当精炼时间为72 h时异黄酮巧克力的感官品质最佳。
2.2.4 调温时间对大豆异黄酮巧克力感官品质的影响
根据预实验结果，在固定精磨温度35 ℃、精磨时间6 h、精炼温度80 ℃、精炼时间36 h条件下，选取调温时间分别为20、25、30、35、40 min，按制备方法进行实验，结果见图4。
巧克力对温度和湿度都很敏感，所以调温过程直接影响巧克力的品质。由图4可知，调温时间不足，巧克力结晶时形成不稳定晶型，成品表面起霜 [23] ，感官评分较低；当调温时间为30 min时，巧克力得到最理想的同质多晶型，同时口感更丝滑，外观更具光泽；当调温时间过长，巧克力表面无光泽且呈灰色，影响巧克力品质。
图4 调温时间对异黄酮巧克力感官品质的影响
2.3.1 工艺条件L 9 (3 4 )正交实验结果及分析
由表5可知，影响大豆异黄酮巧克力感官品质的因素主次顺序为R D > R A > R B > R C ，再以k值进行分析A 2 > A 3 > A 1 、B 2 > B 3 > B 1 、C 3 > C 2 > C 1 、D 2 > D 3 > D 1 ，因此，制备大豆异黄酮巧克力工艺条件的最佳组合是A 2 B 2 C 3 D 2 ，即精磨温度为45 ℃、精磨时间8 h、精炼温度80 ℃、精炼时间72 h、调温时间30 min。
表5 L 9 (3 4 )正交实验结果及极差分析
2.3.2 大豆异黄酮巧克力配方L 16 (4 5 )正交实验结果及分析
由表6可知，影响大豆异黄酮巧克力感官品质的因素主次顺序为R A > R B > R C > R E > R D ，再以k值进行分析A 2 > A 1 > A 3 > A 4 、B 3 > B 2 > B 4 > B 1 、C 3 > C 4 > C 2 > C 1 、D 2 > D 1 > D 3 > D 4 、E 3 > E 4 > E 2 > E 1 ，因此，制备大豆异黄酮巧克力的最佳配方是A 2 B 3 C 3 D 2 E 3 ，即大豆异黄酮添加量为1.25%、可可液块添加量为9%、可可脂添加量为18%、蔗糖添加量为35%、奶粉添加量为8%、食用植物油添加量为28%、卵磷脂添加量为0.5%、香料的添加量为0.25%。
2.3.3 大豆异黄酮巧克力中类雌激素有效摄入量检测结果
按最佳工艺条件制备大豆异黄酮巧克力，随机取样10块，检测其大豆染料木素与染料木苷总量，结果分别为：26.06、32.12、30.58、28.64、31.56、27.22、26.35、25.78、30.97、25.38 mg，平均值为26.47 mg，每块巧克力大豆染料木素与染料木苷总量摄入均为30±5 mg，为合格产品。
表6 L 16 (4 5 )正交实验结果及极差分析
如表7所示，10位具有更年期症状的女性每日服用1块大豆异黄酮巧克力，30 d后更年期各种症状均有所改善，因此大豆异黄酮巧克力对更年期综合症具有一定功效。
表7 受试人员受试后自觉症状描述
将含大豆染料木素与染料木苷（具有类雌激素效应）的大豆异黄酮添加到巧克力配方，通过单因素及正交实验，确定了制备大豆异黄酮巧克力的最佳工艺条件，即在精磨温度为45 ℃、精磨时间8 h、精炼温度为80 ℃、精炼时间72 h、调温时间30 min的工艺条件下，大豆异黄酮添加量为1.25%、可可液块添加量为9%、可可脂添加量为18%、蔗糖添加量为35%、奶粉添加量为8%、食用植物油添加量为28%、卵磷脂添加量为0.5%、香料添加量为0.25%。此条件下制备的大豆异黄酮巧克力对更年期综合症具有一定改善功效。本文确定了更年期女性每人以摄入大豆染料木素与染料木苷总量30 mg/d为有效、经济、适用摄入量，为开发新型天然植物性雌激素保健食品提供有效配方摄入量。大豆异黄酮巧克力特别适于围绝经期女性食用，服用方便，效果明显，是一种具有改善更年期综合症的新型保健食品。
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Preparation of chocolate with soybean isoflavone and the effect on climacteric syndrome
LEI Hai-rong 1 , ZHANG Feng-ran 2 , LIANG Hong-xiang 1
(1. Science and Technology Development Research Center, Changchun University, Jilin Changchun 130022; 2. Yanbian University, Yanji Jilin 133002)
Abstract: The preparation of soybean isoflavone chocolate were optimized through single factor and orthogonal experiments with soybean isoflavone (40% of soybean genistein and genistin) as one of the chocolate ingredients.The total intake of soybean genistin and genistein was 30 mg/d for climacteric women, which was an effective intake for the xenoestrogen effect. Through optimization, the optimum process parameters of soybean isoflavone chocolate were as follows: fine grinding temperature was 45 ℃, fine grinding time was 8 h, refining temperature was 80 ℃, refining time 72 h, attemperation time was 30 min, the ingredients were: soybean isoflavone 1.25%, cocoa mass 9%, cocoa butter 18%, sugar 35%, milk powder 8%, edible vegetable oil 28%, lecithin 0.5%, and spice 0.25%. The soybean isoflavone chocolate prepared by the optimized formula has a certain improvement efficacy to menopausal syndrome.
Key words: soybean isoflavones; chocolate; xenoestrogen effect; climacteric syndrome
DOI: 10.16210/j.cnki.1007-7561.2018.05.006
中图分类号： TS 218
文献标识码： A
文章编号： 1007-7561(2018)05-0029-07
收稿日期： 2018-03-13
基金项目： 吉林省经济结构战略调整项目（2012428）
作者简介： 雷海容，1972年出生，女，工程师.