燕麦蛋白组分分离提取及其SDS-PAGE电泳分析

（1. 山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷 030801；2. 山西农业大学校医院，山西太谷 030801）

摘要： 通过单因素实验对燕麦蛋白组分的分离提取工艺进行了优化，并通过SDS-PAGE电泳对燕麦蛋白组分进行亚基分析。结果表明：燕麦清蛋白提取的最佳温度为40 ℃，球蛋白提取最佳盐浓度为7%，醇溶蛋白提取的最佳乙醇浓度为75%，谷蛋白提取的最佳碱浓度为0.05 mol/L，蛋白质提取率为83.1%。SDS-PAGE实验结果显示：燕麦清蛋白在10~100 kD范围内均有分布，燕麦球蛋白由2个亚基组成，分子量分别在97.4~100 kD和43~66.2 kD范围内，燕麦醇溶蛋白亚基大部分集中在18.39~40.72 kD之间，燕麦谷蛋白部分亚基分布在20.67~26.66 kD与43.29~50.80 kD之间。

燕麦属禾本科燕麦属，生长特性与其他谷物相似，是一年生草本植物 [1] ，适于生长在北纬40.8度到71度之间的地区 [2-3] 。燕麦产量约占世界粗粮产量的57%，在世界谷物生产中排名第六，仅次于小麦、玉米、大米、大麦和高粱 [4] 。我国燕麦播种面积约80万hm 2 ，产量85万t，居世界第八位 [5] 。燕麦中的蛋白质含量（12.4%~24.5%）在谷类食品中是最高的，其中清蛋白7%~11%、球蛋白52%、醇溶蛋白15%、谷蛋白19%~22% [6] ，氨基酸平衡性好，蛋白质功效比超过2.0，生物价为72~75 [7] ，而且清蛋白和球蛋白所占比重大，赖氨酸和天冬氨酸含量高，而脯氨酸和谷氨酰胺含量较低 [1] ，必需氨基酸比例合理，利用率高，是低成本高营养价值蛋白质的潜在来源 [8] 。目前对燕麦麸蛋白质的Osborne分类法已有报道 [9-11] ，但对于燕麦蛋白质的研究报道还较少。本研究旨在优化Osborne法分离提取燕麦蛋白组分工艺的基础上，通过SDS-PAGE电泳，确定燕麦蛋白各组分提取的最佳条件和亚基组成，为燕麦蛋白质的进一步研究和应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

石油醚、无水乙醇、氢氧化钠、氯化钠、三氯乙酸、盐酸、浓硫酸（均为分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；考马斯亮蓝G250、SDS、β-巯基乙醇、溴酚蓝、甲叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺、过硫酸铵、氢氧化钾、甘油、低分子量蛋白质Marker：北京索莱宝科技有限公司。

DYY-7C型电泳仪：北京市六一仪器厂；723可见分光光度计：上海菁华科技有限仪器公司；HH系列数显恒温水浴锅：金坛市科析仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；SHZ-III循环水真空泵：上海亚荣生化仪器厂；TS-2000 ADecoloring Shaker：Kylin-Bell Lab Instrument公司；HC-2064高速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

燕麦籽粒经挑选去杂后，磨制成粉，按料液比1∶5加入石油醚，磁力搅拌脱脂4 h，抽滤除去油脂石油醚混合溶液，沉淀置于空气中待石油醚挥发完全后，收集备用。

1.2.2.1 燕麦清蛋白提取称取一定量脱脂燕麦粉，按料液比1∶10加入蒸馏水，分别在水浴锅中恒温（25、40、50 ℃）搅拌1.5、2、3、4 h，取一定量溶液，以10 000 r/min速度离心5 min，测定上清液中蛋白质量浓度。

1.2.2.2 燕麦球蛋白提取称取一定量脱脂燕麦粉，按照上述步骤除去清蛋白，所得沉淀分别加入NaCl溶液（2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%），磁力搅拌0.5、1、2、3 h，取定量溶液，以10 000 r/min速度离心5 min，测定上清液中蛋白质量浓度。

1.2.2.3 燕麦醇溶蛋白提取称取一定量脱脂燕麦粉，按照上述步骤除去燕麦清蛋白、球蛋白后，所得沉淀中分别加入乙醇溶液（65%、70%、75%、80%、85%、90%），磁力搅拌0.5、1、2、3 h，取一定量溶液，以10 000 r/min速度离心5 min，测定上清液中蛋白质量浓度。

1.2.2.4 燕麦谷蛋白提取称取一定量脱脂燕麦粉，依次提取，除去燕麦清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白后，所得沉淀中分别加入NaOH溶液（0.01、0.03、0.05、0.07、0.09、0.10 mol/L），磁力搅拌0.5、1、2、3 h，取一定量溶液，以10 000 r/min速度离心5 min，测定上清液中蛋白质量浓度。

依照Laemmli等人 [13] 的方法。浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%，样品上样量为5 μL。恒压电泳，电流为16 mA，浓缩胶电压为100 V，分离胶电压为150 V。电泳结束后，电泳胶片先固定3 h后，再染色，脱色结束后，用成像仪进行成像。

2 结果与分析

2.1 提取温度对清蛋白质量浓度的影响

热是使蛋白质变性最常见的物理因素，大多数蛋白质在45~50 ℃时已可觉察到变性，到55 ℃时变性进行得很快。70 ℃以下时蛋白质变性仅涉及非共价键的变化，但在70~80 ℃以上，将会破坏蛋白质的二硫键，产生不可逆变性 [14] 。因此本实验选取了30、40、50 ℃三梯度进行实验，并与室温（25 ℃）条件下进行了比较。由图1可知，除25 ℃外，随提取时间的延长，蛋白质浓度曲线整体呈下降趋势，50 ℃时下降明显，说明此时燕麦清蛋白已经开始变性，造成部分沉淀，使得溶解度降低。在30 ℃和40 ℃下，清蛋白浓度都是在2 h时有所提高，之后随时间延长蛋白浓度有所波动，但总体呈下降趋势。说明随着提取时间的延长，也会造成部分清蛋白的变性沉淀。40 ℃提取2 h时，清蛋白浓度最高，所以确定清蛋白提取温度为40 ℃，时间为2 h。

图1 温度对燕麦清蛋白质量浓度的影响

2.2 NaCl溶液浓度对球蛋白质量浓度的影响

盐以两种不同的方式影响蛋白质的稳定性，低浓度时，离子通过非特异性的静电相互作用与蛋白质作用，稳定了蛋白质的结构；高浓度时，盐具有影响蛋白质结构稳定性的离子特异效应 [15] ，且在相同离子强度下燕麦球蛋白在NaCl溶液中的溶解度大于在一些二价盐溶液中的溶解度 [16] ，由图2可以看出，当盐浓度为7%和8%时，随时间变化，蛋白质量浓度曲线基本重合且最高，说明此时盐离子与燕麦球蛋白相互作用，很好地稳定了蛋白质的结构，使燕麦球蛋白的溶解性达到最大，9%时蛋白质量浓度开始下降，说明此时的盐离子浓度已经破坏了燕麦球蛋白的稳定性，溶解度降低。所以确定盐浓度为7%时最佳。

图2 NaCl溶液浓度对球蛋白质量浓度的影响

2.3 醇溶液浓度对醇溶蛋白质量浓度的影响

有机溶剂以不同方式影响蛋白质的疏水相互作用、氢键和静电相互作用的稳定性。在低浓度时，一些有机溶剂能提高几种酶对变性的稳定性 [17] 。然而在高浓度时，有机溶剂将导致蛋白质变性。由图3可以看出，乙醇溶液体积分数为75%时，提取的醇溶蛋白质量浓度最高，说明此时燕麦醇溶蛋白与乙醇溶液相互作用，稳定了蛋白质结构，溶解度提高，当乙醇溶液体积分数大于75%时，导致了蛋白质变性沉淀，溶解度降低。

图3 醇溶液浓度对燕麦醇溶蛋白质量浓度的影响

2.4 NaOH溶液浓度对谷蛋白提取的影响

由图4可知，氢氧化钠浓度为0.03 mol/L和0.05 mol/L时，随时间延长，蛋白质量浓度曲线开始呈显著上升趋势，2 h之后则上升较缓，且在2 h之后，0.05 mol/L的碱浓度提取的谷蛋白质量浓度最高，故碱溶液浓度确定为0.05 mol/L。添加NaOH会加速淀粉的糊化速度 [18] ，实验结果表明，当碱溶液浓度高于1.0 mol/L后，由于在提取过程中造成燕麦淀粉的糊化，溶液会成胶状，无法离心分离，在下一步研究中可以考虑先将淀粉除去，再进一步研究。

图4 NaOH溶液浓度对燕麦谷蛋白质量浓度的影响

2.5 燕麦蛋白组分SDS-PAGE分析

由图5和图6可知，不同提取条件对蛋白亚基组成有较大影响。燕麦清蛋白亚基在10~100 kD范围内均有分布，25 ℃提取所得燕麦清蛋白亚基条带较少，可见25 ℃条件下未能提取清蛋白有效组分，50 ℃提取所得清蛋白亚基分布与40 ℃有较大不同，结合提取率数据，推测50 ℃的提取条件下，部分蛋白变性导致亚基组分分布发生变化，此外，添加β-ME后，清蛋白的部分亚基条带消失，说明清蛋白中的部分亚基含有二硫键。不同提取条件对燕麦球蛋白的亚基组成影响较小，3个盐浓度提取所得燕麦球蛋白在电泳图谱中均呈现相同的亚基条带，分子量在43~66.2 kD之间，含有二硫键，二硫键断裂后形成的低分子量亚基分别在31~43 kD和14.4~22 kD范围内；燕麦醇溶蛋白亚基分布范围较广，但大部分亚基集中在18.39~40.72 kD之间，与Kim等人 [19] 描述的20~40 kD基本相符，不同醇浓度对燕麦醇溶蛋白亚基组成影响较大，其中乙醇浓度为75%时提取所得的蛋白亚基条带最多，这可能正是造成乙醇浓度为75%时蛋白质量浓度最高的原因，当乙醇浓度为80%时，只提取出了少量的18.39~ 40.72 kD之间的亚基，当乙醇溶液浓度为70%时，还提取出了相对分子质量较小的亚基（9.78~ 18.39 kD），而低分子质量的亚基氨基酸组成不同于典型的醇溶蛋白，它们可能像小麦和大麦一样，主要包含蛋白酶和α-淀粉酶抑制剂 [20] ，燕麦醇溶蛋白大部分亚基不含二硫键。燕麦谷蛋白亚基主要有两条，分别分布在20.67~26.66 kD与43.29~ 50.80 kD之间，随着NaOH浓度的增加，分离胶顶端颜色加深，而20.67~26.66 kD与43.29~ 50.80 kD之间两个亚基组分则逐渐减少，所以推测低浓度的NaOH溶液有利于提取出低分子量的燕麦谷蛋白亚基，而高浓度的NaOH溶液有利于提取出大分子量的亚基，当NaOH浓度为0.5 mol/L时，既可以提取出部分小分子量亚基也可提取出部分大分子量亚基，这可能正是此时燕麦谷蛋白质量浓度最大的原因。

从左到右，泳道0：蛋白标样；泳道1、2、3：清蛋白（25、40、50 ℃）；泳道4、5、6：球蛋白（5%、7%、9%）；泳道7、8、9：醇溶蛋白（70%、75%、80%）、泳道10、11、12：谷蛋白（0.01、0.05、0.1 mol/L）

图5 燕麦蛋白组分电泳图谱（未加 b -ME）

图6 燕麦蛋白组分电泳图（加 b -ME）

3 结论

燕麦清蛋白提取的最佳温度为40 ℃，球蛋白提取的最佳盐浓度为7%，醇溶蛋白提取的最佳乙醇浓度为75%，谷蛋白提取的最佳碱溶度为0.05 mol/L。提取的蛋白含量（占粗蛋白）依次为：清蛋白19.40%、球蛋白36.42%、醇溶蛋白10.29%、谷蛋白17.02%，蛋白质提取率可高达83.1%。SDS-PAGE结果表明：不同提取条件对燕麦清蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的亚基组成有较大影响。燕麦清蛋白亚基在10~100 kD范围内均有分布，燕麦球蛋白由2个亚基组成，分子量分别在97.4~100 kD和43~66.2 kD范围内，燕麦醇溶蛋白亚基大部分亚基集中在18.39~40.72 kD之间，燕麦谷蛋白部分亚基分布在20.67~26.66 kD与43.29~50.80 kD之间，其中燕麦清蛋白和球蛋白含有二硫键。

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(1. School of food science and engineering, Shanxi Agricultural University, Taigu Shanxi 030801; 2. Hospital of Shanxi Agricultural University, Taigu Shanxi 030801)

Abstract: The separation and extraction process of protein components in oat were optimized by single factor experiments and the protein subunit components of oat were analyzed by SDS-PAGE. The results showed that the optimal temperature for extraction of oat albumin was 40 ℃, the optimal salt concentration for globulin was 7%, the optimalethanol concentration for prolamin was 75%, the optimal alkaliconcentration for glutenin was 0.05 mol/L, the extraction rate of oat protein 83.1%. The results of SDS-PAGE showed that the oat albumin distributed in the range of 10~100 kD; the oat globulin was composed of two subunits with molecular weight in the range of 97.4~100 kD and 43~ 66.2 kD respectively; the distribution range of most oat prolamin subunits was 18.39~40.72 kD; and the distribution range of some oat glutenin subunits was between 20.67~26.66 kD and 43.29~50.80 kD.

基金项目： “十三五”国家重点研发计划重点专项（2017YFD0400200）；山西农业大学博士科研启动专项（2016ZZ06）