重组抗原CP4-EPSPS的克隆、<span class="emphasis

(1.深圳市农业科技促进中心，广东深圳 518040；2.农业部农作物种子质量监督检验测试中心(深圳)，广东深圳 518040；3.深圳市作物分子设计育种研究院, 广东深圳 518107)

摘要：构建了一个含有CP4-EPSPS外源基因的细菌表达载体并在E.coliBL21(DE3)中的高效表达，通过SDS-PAGE检测发现，目的蛋白完全以可溶性方式存在于细胞破碎上清液中。收集该上清液并进而通过镍柱亲和层析，CP4-EPSPS重组蛋白纯度可达85%以上，利用Brandford法测定蛋白质浓度为0.9 mg/mL。该蛋白表达和纯化体系可为转基因植物、食品等蛋白检测用抗体提供稳定免疫性抗原，同时也可为蛋白标准物质研制提供稳定物质基础。

世界上第一例转基因抗草甘膦大豆问世以来，转基因作物的应用与推广已有16载，我国每年从国外进口大量的转抗草甘膦CP4-EPSPS的作物和食品。随着人们对食品及转基因食品安全的关注，建立转基因作物、苗、种子及其产品的检测技术体系极为重要。我国目前市场上已经开发出多种商业化的基于蛋白质测定的转基因检测试剂盒，然而由于生产工艺的不同，表达出的外源蛋白通过参考物质定量的量值难以溯源到上一级的计量标准，因此造成不同厂商不同试纸条测定结果不准确和缺乏可比性，为此将对转基因的安全监管带来隐患，而且会引发法律、贸易纠纷等经济和社会问题。面对我国缺少基于统一标准的溯源蛋白，为此建立高效、快速、大量制备纯度高的重组蛋白CP4-EPSPS技术体系尤为重要。本研究通过构建细菌表达载体在大肠杆菌进行表达，建立大量制备高纯度的重组蛋白CP4-EPSPS技术体系，可为转基因植物、食品等蛋白检测用抗体提供稳定免疫性抗原，同时也可为蛋白标准物质研制提供稳定物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料

转基因大豆种子，表达载体pet30a，E.coliBL21(DE3)感受态细胞为实验室保存。

T4 DNA连接酶、NdeI限制性内切酶、XhoI酶、Taq DNA聚合酶等酶购自TaKaRa公司、卡那霉素Kan购自深圳市百胜科创生物技术有限公司。

1.2 方法

在NCBI上获取CP4-EPSPS基因序列(登录号为AF464188.1)，使用Primer5软件设计引物，上下游引物5'端分别增加NdeI和XhoI酶切位点，其中上游引物F为：AGATATACATATGTCTCACGGTGCAAGCAGCC，下游序列R为：GTGCTCGAGGGCAG-CCTTCGTATCGGAGA。

将大豆种子研磨成粉末，用Qiagen核酸提取试剂盒提取基因组DNA。以提取的DNA作为模板，进行PCR扩增。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，进行30个循环；最后72 ℃延伸2 min；10 ℃降温2 min。

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分离目的片段，采用胶回收试剂盒回收PCR产物，回收产物与pet30a载体进行连接。连接产物通过42 ℃热击，转化进入E.coliBL21(DE3)感受态细胞，然后将转化菌液涂于LB平板(含卡那霉素)上，37 ℃条件下培养过夜。挑取单克隆进行PCR验证及测序验证，将正确的菌落重新接种，-80 ℃条件下保菌及提取质粒在-20 ℃长期保存。

取出-80 ℃保存的菌，在冰上缓慢解冻或者取保存的质粒进行热击转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，然后接入含Kan的LB液体培养基中，37 ℃中振荡培养至OD600为0.8，加入终浓度为1 mM的IPTG，在25 ℃低温下诱导过夜表达。

收集菌体，超声，离心，取上清，上样至镍柱，分别以15 mM、60 mM、150 mM以及300 mM咪唑洗涤，将各洗涤组分进行电泳，选择最优的咪唑洗涤浓度。将最优咪唑洗脱浓度洗涤的组分进行10 mM Tris-HCl

使用0.15 mmol/L NaCl将牛血清白蛋白标准品(浓度20 mg/mL)稀释40倍使终浓度为0.5 mg/mL；进行两组平行样，各取4支试管分别加入10 μL、20 μL、30 μL、40 μL稀释的标准品，然后分别加入0.15 mmol/L NaCl 190 μL、180 μL、170 μL、160 μL，另取一试管作为空白(200 μL 0.15 mmol/LNaCl)；取20 μL纯化产物，加入180 μL 0.15 mmol/L NaCl；然后将每试管分别加入2 mL考马斯亮蓝(G-250)染液，充分振荡混匀，室温条件下静置30 min；使用全波长分光光度计(DU series600)分别测定A590，最终绘制标准曲线以及计算样品蛋白含量。

2 结果与分析

2.1 表达载体的构建及鉴定

采用本研究设计的上下游引物进行PCR扩增，将扩增产物切胶纯化后，以NdeI和XhoI限制性内切酶进行双酶切，同时pet30a载体也进行双酶切。将双酶切后线性化的pet30a载体与双酶切的PCR产物进行连接，获得带有CP4-EPSPS基因的质粒载体(pBPIT-CP4-EPSPS)，其结构如图1。

以通用引物进行双向测序(部分结果见图2和图3)，测序结果经过BLAST比对，测序序列与原NCBI序列完全一致。

2.2 目的蛋白纯化条件优化

本研究采用镍柱对目的蛋白进行纯化，分别以15 mM、60 mM、150 mM以及300 mM咪唑进行洗涤，将4个梯度咪唑浓度洗涤的组分进行电泳，结果见图4。使用15 mM咪唑洗涤只能获得极少部分的蛋白(见条带4)，使用60 mM咪唑洗涤只能获得极少部分目的蛋白(见条带5)，使用300 mM咪唑进行洗涤获得较多的杂蛋白(见条带7)，最优的咪唑洗涤浓度为150 mM(见条带6)。

图4 CP4-EPSPS的表达和纯化结果
注：1. 质粒pet30a未诱导全菌；2. 质粒pet30a诱导后全菌；3. pBPIT-CP4-EPSPS质粒未诱导全菌；4.CP4-EPSPS蛋白15mM咪唑洗涤；5.CP4-EPSPS蛋白60mM咪唑洗涤；6.CP4-EPSPS蛋白150mM咪唑洗涤；7.CP4-EPSPS蛋白300mM咪唑洗涤；M. 分子量Marker

2.3 目的蛋白的表达和定量分析

通过离心收集表达菌体，再经过超声破碎、离心后，分为上清和沉淀，然后使用SDS-PAGE电泳进行检测，检测结果见图5。由图5可知，所表达的目的蛋白CP4-EPSPS在细菌细胞内绝大部分是以可溶性方式存在于细胞上清液中(可见条带6)，以包涵体形式存在细胞中很少(见条带5)。使用镍柱纯化细胞上清液，最终获得高纯度的目的蛋白(可见条带7)，将150 mM咪唑洗脱获得的组分进行10 mM Tris-HCl透析(可见条带8)，该组分的电泳纯度>85%，利用Brandford法测定蛋白质浓度为0.9 mg/mL。

图5 CP4-EPSPS蛋白的表达和纯化结果
注：1. 质粒pet30a未诱导全菌；2. 质粒pet30a诱导后全菌；3. pBPIT-CP4-EPSPS质粒未诱导全菌；4. pBPIT-CP4-EPSPS质粒诱导后全菌；5. pBPIT-CP4-EPSPS质粒诱导超声沉淀；6. pBPIT-CP4-EPSPS质粒诱导超声上清；7. CP4-EPSPS蛋白150mM咪唑洗涤；8. CP4-EPSPS蛋白透析后；9. Marker

3 讨论

转基因食品的安全性一直备受人们的关注，其安全性评价需要以转基因成分检测结果为基础。基于转基因作物、食品等的转基因成分检测技术可分为两大类：一类是基于外源核酸(DNA)成分的检测方法[1-3]，另一类是基于外源核酸表达的外源蛋白质通过免疫学的分析方法[4-5]。目前，基于蛋白质的检测技术在植保植检、农产品质量安全、食品安全、生命科学研究、生物产业化进程等领域的应用越来越广泛。在全球范围内所有已经商业化的转基因作物中，种植和销售最为广泛的是含抗草甘膦CP4-EPSPS转基因作物。我国每年进口3000多万t大豆，而且年年在增加，这些大豆绝大部分来自美国和巴西转基因大豆。因此，我国应该尽快研究、制定和建立针对特异性蛋白质的检测鉴定技术体系，为我国转基因作物及食品的安全性检测、评价保驾护航。

本研究构建了一个含有CP4-EPSPS外源基因的细菌表达载体并在大肠杆菌BL21菌株中的高效表达，通过SDS-PAGE检测发现，目的蛋白完全以可溶性方式存在于细胞破碎上清液中。收集该上清液并进而通过镍柱亲和层析，CP4-EPSPS重组蛋白纯度可达85%以上，利用Brandford法测定蛋白质浓度为0.9 mg/ml。该蛋白表达和纯化体系可为CP4-EPSPS转基因植物蛋白检测用抗体提供稳定免疫性抗原，同时也可为蛋白标准物质研制提供稳定物质基础。

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Cloning,expression and purification of recombinant antigen CP4-EPSPS

(1.Shenzhen Agricultural Science and Technology Promotion Center, Shenzhen Guangdong 518040; 2.Crop Seed Quality Supervision, Inspection and Test Center of Ministry of Agriculture (Shenzhen)， Shenzhen Guangdong 518040； 3.Shenzhen Crop Molecular Design and Breeding Institute，Shenzhen Guangdong 518107)

Abstract：A bacterial expression vector containingCP4-EPSPSexogenous gene was constructed and expressed efficiently inE.coliBL21(DE3). SDS-PAGE showed that the target protein was completely soluble in the cell supernatant liquor. The supernatant was collected and further purified by nickel column affinity chromatography. The purity ofCP4-EPSPSprotein was above 85%, and the protein concentration was 0.9 mg/mL determined by Brandford method. The protein expression and purification system can provide stable immune antigen for the transgenic plants, food and other antibody for protein detection, and also provide a stable material basis for the preparation of protein standard material.

基金项目：转基因新品种培育重大专项(2009ZX08001-023B)，深圳市技术创新项目(CXZZ20120614165508810)

重组抗原CP4-EPSPS的克隆、表达和纯化