表1响应面试验因素水平
水平因素酶用量(A)/%pH(B)酶解温度(C)/℃微波萃取时间(D)/min-10.94.545801.25501011.55.55512
刘 霞，廖梅香，张 洁，林银顺，范小娜
(赣南医学院 药学院，江西 赣州 341000)
摘 要：采用Box-Benhnken中心组合实验和响应面分析法,在单因素试验基础上,以酶用量、pH、酶解温度和微波萃取时间为影响因素，多糖提取率为响应值，对微波辅助酶法提取广枣多糖的工艺进行优化。结果表明最佳工艺为：酶用量1.2%，pH 5.5，酶解温度45 ℃，微波萃取时间8 min。按此工艺条件，广枣多糖提取率可达42.56%。
关键词:广枣；多糖；微波辅助；酶法
广枣为漆树科植物南酸枣[Choerospondias axillaris(Roxb.) Burtt et Hill.]的干燥成熟果实，又名五眼果、鼻涕果、酸枣、野枣子等，是蒙古族常用药材[1]。广枣中的化学成分主要包括多糖、黄酮类、有机酸、鞣质、甾醇、香豆素、挥发油、氨基酸、酚性成分及多种无机元素等[2]。广枣多糖是广枣中重要的生物活性物质之一，目前提取广枣多糖的方法常用的有回流法[3-5]、微波法[6]及超声法[7]等，且多为正交设计，不能考察各因素交互作用对多糖提取率的影响。本研究将微波辅助酶法技术应用到广枣多糖提取中，采用Box-Benhnken中心组合实验和响应面分析法[8-9]优化广枣多糖的提取工艺，以期为广枣资源的综合开发应用提供技术依据。
广枣药材:市售，经赣南医学院程齐来教授鉴定为漆树科植物南酸枣的干燥成熟果实。
葡萄糖对照品：北京索莱宝科技有限公司；纤维素酶(5×104u·g-1)：江苏锐阳生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。
202A-2电热干燥箱，上海阳光试验仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SHA-C数显水浴恒温振荡器，金坛市城东新瑞仪器厂；TDL-50B台式离心机，上海安亭科学仪器厂；PB-10酸度计，赛多利斯科学仪器有限公司；BL-1000A型高速多功能粉碎机，浙江省永康市松青五金厂；WF-4000微波快速反应系统，上海屹尧分析仪器有限公司；UV-6100PCS型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。
1.2.1 标准曲线的绘制[8]
采用苯酚-硫酸法以提取液中多糖的质量浓度(X)为横坐标，吸光度值(Y)为纵坐标绘制标准曲线，所得回归方程为：Y=0.082 8X+0.031 0，R2=0.999 7。
1.2.2 广枣多糖的提取[8]
广枣细粉的制备：将烘干的广枣粉碎后，过60目筛，密封好后置于干燥器中保存。
酶处理：准确称取一定量广枣粉末置于250 mL锥形瓶中，加入一定量纤维素酶，用盐酸调pH，按照设定程序酶法提取后，90 ℃灭酶20 min。
微波萃取：将酶处理溶液转入微波萃取系统中，微波萃取一定时间后，抽滤，浓缩至一定体积，得浓缩液。
醇沉：将浓缩液加入3倍体积的乙醇，摇匀，静置过夜。
干燥：将醇沉液3 000 r/min 离心10 min，沉淀依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤，并置于恒温干燥箱中干燥，得广枣多糖粗提物。
1.2.3 多糖提取率测定
精密称取广枣多糖粗提物适量，加蒸馏水使其溶解，并定容至50 mL容量瓶中；精密量取2.5 mL提取液，按一定比例稀释，根据1.2.1项下标准曲线的测定方法，测定其吸光度值，计算广枣粗多糖中多糖提取率。
多糖提取率/%=样品溶液中葡萄糖质量浓度×样品溶液稀释倍数×反应液体积/粗提物重量×100
1.2.4 单因素试验
采用单因素试验研究酶用量、pH、酶解温度、酶解时间及微波萃取时间对广枣多糖提取效果的影响。
1.2.5 响应面试验设计
根据单因素试验结果，酶解时间对多糖提取率影响不大，固定酶解时间为1 h。以酶用量(A)、pH(B)、酶解温度(C)及微波萃取时间(D)为自变量，以-1，0，+1代表自变量的低、中、高水平，以多糖提取率为响应值进行响应面分析。试验因素水平见表1。
表1响应面试验因素水平
2.1.1 酶用量对广枣多糖提取率的影响
从图 1 可以看出，酶用量从0.3%～1.2%递变时，多糖提取率增幅比较明显；酶用量从1.2%～1.5%递变时，多糖提取率变化不大；酶用量在1.5%～1.8%之间时，多糖的提取率反而下降。这可能是因为酶用量比例为1.2%时，酶与底物浓度达到相对饱和状态，后续增加酶用量的比例(>1.5%)，会对多糖组分产生包埋效应，反而抑制了酶解反应，不利于多糖组分的浸出[10]。从节省成本角度出发，将最佳酶用量的比例定为1.2%。
图1 酶用量对多糖提取率的影响
2.1.2 pH对广枣多糖提取率的影响
由图2可知，当pH从3.5增至5.0时，增幅最大；随后再增加pH，多糖的提取率逐渐下降。这可能是由于pH过小或过大都能使酶蛋白变性而失活[11]，从而影响多糖提取率，因此选择酶解体系pH以5.0为宜。
图2 pH对多糖提取率的影响
2.1.3 酶解温度对广枣多糖提取率的影响
从图3 可以看出，酶解温度从40 ℃增加至50 ℃时，多糖的提取率逐步增加。当酶解温度超过50 ℃时，多糖提取率呈下降趋势。这是因为酶活性都有最适温度，偏离此最适温度时，温度越低或者越高时，其活性越小[12]。因此，将最佳酶解温度定为50 ℃。
图3 酶解温度对多糖提取率的影响
2.1.4 酶解时间对广枣多糖提取率的影响
由图4可知，随着反应时间的增加，酶解反应越充分，多糖溶出速率增快，因此多糖提取率先呈上升趋势。当酶解时间达到1.0 h时，多糖已基本溶出，提取量达到最大值，而后提取效果逐步减弱。这可能是因为酶解时间过长，易造成多糖类结构被破坏[13]。故本试验选择最佳酶解时间为1.0 h。
图4 酶解时间对多糖提取率的影响
2.1.5 微波萃取时间对广枣多糖提取率的影响
由图5可知，随着微波萃取时间的延长，细胞通透性逐渐增强，多糖溶出速率增快，因此多糖提取率先逐渐增加，当达到10 min时，多糖提取量达到最大值，随后多糖提取效果开始下降。这可能是因为微波时间达到10 min时，广枣中多糖已充分溶出，达到饱和，继续延长微波时间，传质阻力增加，不利于多糖的溶出，且会促进多糖分解，致使提取率下降。因此后续实验中选择微波萃取时间以10 min为宜。
图5 微波萃取时间对多糖提取率的影响
2.2.1 响应面试验结果及方差分析
响应面分析方案与结果见表2。应用 Design-Expert 8.0.6软件对表 2 中的试验数据进行多元回归拟合，得到的拟合模型为Y=-235.35-21.10×A+67.20×B-0.19×C+25.80×D+3.82×A×B+1.38×A×C-3.33×A×D+0.30×B×C-5.09×B×D+0.21×C×D-15.08×A2-3.28×B2-0.06×C2-0.36×D2。该模型的相关系数R2=95.55%，调整系数
均大于90%，表明方程对试验有较好的拟合性，试验误差小，说明可以用该模型来拟合广枣多糖提取率的理论预测。
由方差分析结 果 ( 表 3 ) 可 知 ，一次项A、B、C、D、交互项AC、AD、BD、CD及二次项A2、C2、D2的P值均小于0.05，表明酶解温度、pH、 微波萃取时间和酶用量对广枣多糖提取率影响显著，其中酶解温度和pH的影响都达到了极显著水平。四个因素对广枣多糖提取率影响主次(主→次)顺序为酶解温度>pH>微波萃取时间>酶用量。交互项AC、AD、BD和CD的P值均小于0.01，表明酶用量与酶解温度、酶用量与微波萃取时间、pH与微波萃取时间、酶解温度和微波萃取时间的交互作用对多糖提取率的影响达到了非常显著的水平。
表2 Box-behnken中心组合试验结果
表3响应面方差分析结果
注：**,P<0.01，差异极显著；*，P<0.05，差异显著。
2.2.2 响应面交互作用分析及最佳提取工艺研究
各试验因素交互作用对广枣多糖提取率影响的3D分析结果见图6。由图6可知，酶解温度对广枣多糖提取率影响最显著，表现为曲面较陡；pH影响次之，表现为曲面较平滑；最后为微波萃取时间和酶用量，表现为曲面更平缓。酶用量与酶解温度、酶用量与微波萃取时间、pH与微波萃取时间、酶解温度和微波萃取时间的交互作用对多糖提取率影响非常显著，与表3中交互项的F值及P值的分析结果相一致。
运用Design-Expert 8.0.6的响应面分析软件对所建立的模型进行参数优化，得到最佳工艺参数为：酶用量1.2%，pH 5.5，酶解温度45 ℃，微波萃取时间8 min，在此条件下预测多糖提取率为42.02%。为检验模型的可靠性，采用上述最佳提取条件，进行3次平行实验，实际提取率为42.56%，理论提取率为42.02%，相对误差1.29%，说明该模型可以较好地预测广枣多糖的理论提取量。
图6 各两因素交互作用对广枣多糖提取率影响的响应面图
由表4可知，相比酶法联合回流法和单技术回流法，酶法联合微波辅助法提取广枣中的多糖得率最高，对广枣细胞组织结构破坏更加明显，而且该工艺更加省时、高效、清洁、安全，表明此法提取广枣多糖的工艺具有实际应用价值。
表4不同提取方法提取多糖的比较
根据所建立的响应面模型，以广枣中多糖的提取率最大为优化条件，得出最佳工艺参数为：酶用量1.2%，pH 5.5，酶解温度45 ℃，微波萃取时间8 min，在该实验条件下多糖提取率预测值为42.02%，实际提取率为42.56%(n=3)，与预测值吻合，说明该模型可以很好地预测广枣多糖的提取工艺条件。
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LIU Xia, LIAO Mei-xiang,ZHANG Jie,LIN Yin-shun,FAN Xiao-na
(College of Pharmacy, Gannan Medical University, Ganzhou Jiangxi 341000)
Abstract：The technology of extracting polysaccharide from fructus choerospondiatis by microwave-assisted enzymetic method was optimized by Box-Benhnken central composite design and response surface analysis based on the single factor experiment with enzyme dosage, pH, enzymolysis temperature and microwave extraction time as the factors and the extraction yield of polysaccharides as the response value.The results showed that the optimal conditions of extraction were as followings: enzyme dosage 1.2% , pH 5.5, enzymolysis temperature 45 ℃ ,and microwave extraction time 8 min. Under the conditions, the yield of polysaccharide from fructus choerospondiatis was up to 42.56%.
Key words：fructus choerospondiatis; polysaccharide; microwave-assisted; enzymetic method
收稿日期：2017-03-14
基金项目：江西省教育厅科技项目( GJJ160971)；江西省卫生厅中医药科研基金课题(2013A097)
作者简介：刘霞，1980年出生，女，湖北人，硕士，高级实验师.
中图分类号：TS 20
文献标识码：A
文章编号：1007-7561(2017)05-0042-05
通讯作者：范小娜，1964年出生，教授，硕导.