微溶剂体系酶法合成松香酸淀粉酯

巫 佳1,林日辉2,贺俊斌1,何超红1,兰玉荣1

(1.广西民族大学海洋与生物技术学院广西高校微生物与植物资源利用重点实验室,广西南宁 530006;2.广西民族大学化学化工学院化学与生物转化过程新技术重点实验室,广西南宁 530006)

摘 要:以松香和木薯淀粉为原料,叔戊醇为溶剂,研究了微溶剂体系下采用酶催化酯化法合成松香酸淀粉酯。通过单因素实验考察了松香与淀粉质量比、反应时间、反应温度、固定化脂肪酶用量对松香酸淀粉酯取代度的影响,确定最适反应条件为:松香与淀粉的质量比为4∶1,反应温度为55℃,反应时间为10 h,固定化脂肪酶用量为4%(以淀粉质量计)。通过红外光谱分析产物的结构发现,产物在1 725 cm-1处出现了酯羰基C=O的伸缩振动吸收峰,表明松香与淀粉发生了酯化反应合成了松香酸淀粉酯;通过X射线衍射分析和扫描电镜分析产物的结构发现,酯化反应没有破坏淀粉原有的晶体型貌和结构。对产物的亲油性能进行研究,结果表明,与原淀粉相比酯化产物在正辛烷中对橄榄油的吸附能力增加了166.67%。微溶剂体系的反应大大降低了成本,提高了产物的量。

关键词:松香;木薯淀粉;酯化;微溶剂体系

淀粉被广泛地用作准备食物的功能组件,来源广且价格低廉,是人类和家畜的主要能量来源。研究淀粉的基本性质,如平均分子量、结构以及两者与

淀粉功能的关系等,是食品领域的重点研究方向。淀粉是由多个葡萄糖单元构成的多羟基天然高分子化合物,分子式为(C6H10O5n,具有亲水性,是植物储藏能量的最主要方式。在科学技术高速发展的今天,淀粉和淀粉制品在生活以及工业等方面的应用日益广泛,促进了淀粉应用技术的深入研究[1]。淀粉羟基酯化是对其性质和结构进行改性中最常见的一种,酯化淀粉被应用于食品、医药、材料和污水处理工业等方面[2-3]。松香主要成分为二萜树脂酸,分子式为C19H29COOH,其结构中的三环菲骨架与长链脂肪酸烃基具有亲油性[4]。松香是用于聚合物改性的重要原料,松香亲油基团的引入增强了淀粉的亲油性,从而获得亲水又亲油的两性淀粉酯化合物。近年来,生物催化剂在有机合成方面的应用已比较成熟。脂肪酶是应用最广泛的酶,催化效果较好,且无需辅助因子。固定化的脂肪酶是合成松香酸淀粉酯的重要生物催化剂。与传统的化学催化剂法相比,生物酶催化法具有催化生产成本低、反应条件温和、反应选择性高、分离提纯产物较简单、反应专一性强、副产物少等优点[5-7]。之前报道过的酶促松香酸淀粉酯反应[5-7],在均相溶液体系下反应,用一定量的二甲亚砜溶液溶解淀粉和松香,再加入脂肪酶催化反应,但由于二甲亚砜对淀粉的溶解度较低,且后期样品析出的工艺较为复杂,导致成本过高、产量较低,不适用于工业生产应用。微溶剂体系是通过微量的叔戊醇溶液助溶松香,以松香为溶剂且淀粉依然保持固体的状态进行反应,并在酶催化下与松香发生表面性反应,因此微量的溶剂体系中可以加入大量的松香和淀粉,后期样品的提取简单快捷,溶剂可重复利用,大大提高了产物的产量,降低了成本,更适合于工业生产。本实验在微溶剂体系下采用酶催化酯化法合成松香酸淀粉酯。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

木薯淀粉(食品级):广西岑溪市三角淀粉有限责任公司;松香:广西梧州松脂股份有限公司;固定化脂肪酶Novozym435:诺维信公司;叔戊醇、无水乙醇、丙酮、氢氧化钠、盐酸(均为分析纯):成都市科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

HPS-250生化培养箱:哈尔滨市东明医疗仪器厂;Magna 550型傅立叶变换红外光谱仪:美国赛默飞世尔科技公司;TU-19双光束紫外可见分光光度计:北京普析通用仪器有限责任公司;THZ-C恒温振荡器:江苏太仓市实验设备厂;高速离心机,日本日立公司;HJ-6A多头磁力搅拌器:金坛市鸿科仪器厂;SUPPA 55型场发射扫描电镜:ZEISS;UItime IV组合型X射线衍射仪:日本理学;DHG-9146A电热鼓风干燥箱:上海精宏实验设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 松香酸淀粉酯的合成方法

在150 mL磨口三角瓶中,添加6 g松香酸和20 mL叔戊醇,一定温度下搅拌使松香酸溶解,之后添加1.5 g的木薯淀粉,等到反应体系混合充分后,再加入60 mg Novozym435脂肪酶,恒温反应10 h。反应结束后,待温度冷却到室温,过滤去掉固体脂肪酶,离心去掉上清液取沉淀物,用丙酮洗涤3次,每次加入30 mL丙酮,再用无水乙醇洗涤30 min后离心,产物放于鼓风烘箱中65℃恒温干燥。松香酸淀粉酯合成路线如图1所示[5-9]

图1 松香酸淀粉酯的合成路线

1.3.2 单因素实验

以叔戊醇为反应体系、固定化脂肪酶为催化剂,正常大气压下反应获得松香木薯淀粉酯,选定松香与淀粉质量比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)、反应温度(40、45、50、55、60℃)、反应时间(4、6、8、10、12 h)、固定化脂肪酶用量(1%、2%、3%、4%、5%,以淀粉质量计)4个因素进行实验,研究不同条件对松香木薯淀粉酯取代度(Ds)的影响。

1.4 分析方法

1.4.1 酯化淀粉取代度的测定

精准称取一定量的样品置于150 mL磨口三角瓶中,然后倒入25 mL蒸馏水、5 mL无水乙醇、10 mL 0.1 mol/L的NaOH标准溶液,50℃水浴搅拌3 h,待体系温度冷却到室温后,再加入几滴酚酞溶液使溶液呈红色,之后用0.01 mol/L的HCl标准溶液

滴定,滴定终点为颜色由红色变成无色,并且30 s不变色,记录滴定用掉的盐酸量,实验平行3次,同时做空白实验求出空白和样品所消耗的盐酸体积V1和V2。根据式(1)、式(2)计算松香酸淀粉酯的Ds[10-12]

式中:Ds-淀粉分子中每个葡萄糖单元上的羟基平均被取代的数目;V1-滴定空白样消耗的盐酸标准液的体积,mL;V2-滴定样品消耗的盐酸标准液的体积,mL;C-盐酸标准液的浓度,mol/L;m-样品的质量,mg;285-松香基团的平均相对分子质量;162-淀粉葡萄糖单元的相对分子质量;w-松香基团的质量分数。

1.4.2 结构表征

扫描电镜分析:用SUPRA 55型场发射SEM(ZEISS公司)观察样品表面形态变化;红外光谱分析:Magna 550型傅立叶变换红外光谱仪测定试样的红外谱图,采用溴化钾压片,测量波数范围400~4 000 cm-1;X射线衍射分析:用IV组合型X射线衍射仪(理学公司)对试样进行XRD表征,CuKa射线,Ni滤波,管电流20 mA,管电压36 kV,扫描速率4(°)/min,扫描范围10~30°。

1.4.3 吸油率的测定

以正辛烷为溶剂加入适量橄榄油于100 mL三角烧瓶中,再分别精确称取一定量的淀粉和样品,于30℃搅拌4 h,离心取上清。以正辛烷为空白,用紫外—可见分光光度计测定橄榄油在270 nm处的透光率,根据透光率计算出淀粉与样品在正辛烷中的吸油率[13]

2 结果与分析

2.1 不同条件对酯化淀粉取代度的影响

2.1.1 松香与淀粉的质量比

在反应时间为12 h、反应温度为45℃、酶用量为3%的条件下,研究两底物质量比对取代度的影响,结果见表1。由表1可知当松香与淀粉的质量比从1∶1增加到4∶1时,取代度增加;当松香与淀粉的质量比增大到5∶1时,相比4∶1时取代度不再增加。由于本实验用的是微溶剂体系,增加松香的量可以提供过量的酰基供体,但是反应只在淀粉颗粒表面,淀粉颗粒表面的羟基数量较少,过量地增加松香的量取代度增加不大。

表1 松香与淀粉的质量比对松香酸淀粉酯取代度的影响

2.1.2 反应时间

在反应温度45℃、松香与淀粉的物料比4∶1、酶用量3%的条件下,反应时间对反应的影响如表2所示。由表2可知,4 h至10 h取代度逐渐增大,反应10 h后取代度基本恒定。这是因为反应刚开始时体系内松香的浓度较大,反应向生成松香酸淀粉酯的方向进行,一段时间后,淀粉颗粒表面引入松香酸基团,一方面空间位阻增大,导致松香分子难以向淀粉颗粒表面靠近;另一方面淀粉颗粒表面的羟基数与整个淀粉颗粒的羟基数相比少了很多,以至于表面可反应的羟基可能接近饱和。另外,由于在反应过程中,搅拌或者液流产生的切割作用,可能使得一些固定化酶从载体上掉落下来,使得酶的催化效率下降[14]

表2 反应时间对松香酸淀粉酯取代度的影响

2.1.3 反应温度

在酶用量为3%、松香与淀粉物料比为4∶1、反应时间为10 h的条件下,只改变温度,观察其对反应的影响,结果见表3。由表3可知,温度由40℃到55℃时取代度逐渐增大,温度超过55℃时,随着温度的升高,取代度减小,原因可能是温度过高使得部分固定化脂肪酶失活。

表3 反应温度对松香酸淀粉酯取代度的影响

2.1.4 酶用量

在松香与淀粉物料比为4∶1、反应时间10 h、反应温度为55℃的条件下,探究酶用量对取代度的影响,结果见表4。由表4可知,随着固定化脂肪酶添加量的增加,松香酸淀粉酯的取代度增加,但当固定化脂肪酶用量超过4%时,再增加酶用量松香酸淀粉酯的取代度基本保持稳定。

表4 酶用量对松香酸淀粉酯取代度的影响

2.2 松香酸淀粉酯的表征分析

2.2.1 X射线衍射分析

原淀粉和松香酸淀粉酯样品(Ds=2.93× 10-3)的X射线衍射结果见图2。原淀粉在15.0、17.0、18.0、23.0°处均出现较强的衍射峰,表明木薯淀粉具有明显的结晶结构。样品的衍射结果与淀粉没有明显的差别,表明酯化反应仅发生在淀粉颗粒的表面,没有破坏淀粉的结晶结构。

图2 X射线衍射图

a木薯淀粉;b松香木薯淀粉酯

2.2.2 SEM扫描电镜分析

由图3可知,原淀粉颗粒呈现椭圆形或者圆形,表面平滑,无小裂缝或破面。经酯化后的淀粉仍与原淀粉颗粒型貌相似,表明酯化反应发生在淀粉颗粒的表面,现象与X射线衍射分析结果相符。

图3 SEM图

a木薯淀粉;b松香木薯淀粉酯

2.2.3 红外光谱分析

松香酸淀粉酯样品(Ds=2.93×10-3)的红外吸收光谱分析图如图4所示。图4a木薯淀粉在3 500~3 200 cm-1之间有一峰形较宽的氢键缔合的O-H伸缩振动;2 930 cm-1附近为C-CH2-C伸缩振动;1 200~1 000 cm-1为C-O伸缩振动吸收峰;图4b松香酸淀粉酯在1 725 cm-1附近出现了一个酯羰基C=O伸缩振动特征峰,说明松香和淀粉发生了酯化反应,在淀粉分子上引入了松香基团,而没有改变淀粉的整体结构,也没有破坏淀粉表面的结晶结构。

图4 红外光谱图

a木薯淀粉;b松香木薯淀粉酯

2.3 吸油率的测定

松香酸淀粉酯样品(Ds=2.93×10-3)的吸油能力如表5所示。由表5可知,松香酸淀粉酯与原淀粉相比,其吸油能力提升了166.67%。这是由于松香与淀粉的反应,使得淀粉颗粒上结合了松香的亲油基团,导致淀粉的亲油能力增加,样品在正辛烷中所吸附的橄榄油量增加。

表5 木薯淀粉与松香酸淀粉酯在正辛烷中的吸油率

3 结论

在微溶剂体系下,用固定化脂肪酶Novozym 435催化合成松香酸淀粉酯,通过单因素实验确定最适反应条件为:松香与淀粉的质量比为4∶1,反应温度为55℃,反应时间为10 h,固定化脂肪酶用量为4%(以淀粉质量计)。通过红外光谱分析,酯化改性后在1 725 cm-1处呈现酯羰基C=O伸缩振动吸收峰,表明木薯淀粉颗粒表面引入了松香羧基基团形成淀粉酯化物。通过扫描电镜与X-衍射射线分析可知,反应后的酯化物仍保持原淀粉颗粒型貌,呈现椭圆形或者圆形,表面平滑,无小裂缝或破面,表明反应只发生在淀粉颗粒表面。由于接入了松香基团,提高了淀粉的亲油性质,所以吸油能力比原淀粉

提高了166.67%。酶催化法合成酯化淀粉具有天然无污染、反应效率高、条件温和等优点,微溶剂体系提高了产物的产量,降低了反应成本,更适合于工业生产。

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Enzymatic synthesis of rosin acid starch ester in micro-solvent system

WU Jia1,LIN Ri-hui2,HE Jun-bin1,HE Chao-hong1,LAN Yu-rong1
(1.Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Utilization of Microbial and Botanical Resources,College of Marine Sciences and Biotechnology,Guangxi University for Nationalities,Nanning Guangxi 530006;2.Key Laboratory of New Techniques for Chemical and Biological Conversion Process,School of Chemistry and Chemical Engineering,Guangxi University for Nationalities,Nanning Guangxi 530006)

Abstract:The synthesis of rosin acid starch ester catalyzed by lipase under the micro-solvent system was studied by using the materials of rosin and cassava starch and tertiary amyl alcohol as the solvent.The effect of the factors,including rosin-starch ratio,reaction time,reaction temperature and dosage of lipase,on the degree of substitution(Ds)of rosin acid starch ester were mainly analyzed.The optimal condition was rosin-starch ratio 4∶1,reaction temperature 55℃,reaction time 10 h,dosage of lipase 4%.The structure of the product was analyzed by FT-IR,XRD and SEM.The results showed that a C=O stretching vibration absorption peak at 1 725 cm-1was observed,which indicated the rosin and starch was formed into rosin acid starch ester,with keeping the original crystal morphology and structure of starch.And the lipophilicity of rosin acid starch ester was investigated.Compared with the cassava starch,the oil-absorption capacity of rosin acid starch ester for olive oil was increased by 166.67%in octane.The reaction of micro-solvent system largely reduced the cost and increased the quantity of products.

Key words:rosin;cassava starch;esterification;micro-solvent system

中图分类号:TS 231

文献标识码:A

文章编号:1007-7561(2016)06-0082-05

收稿日期:2016-05-02

基金项目:广西民族大学大学生创新创业训练计划项目(201510 608037)

作者简介:巫佳,1991年出生,男,硕士研究生.

通讯作者:林日辉,1979年出生,男,研究员.