橄榄油实际与理论ECN42甘三酯含量绝对差值测定方法研究

摘要：介绍了理论ECN42甘三酯含量的计算方法，考察了测定实际ECN42甘三酯含量的液相色谱条件，研究了方法的重现性和再现性，建立了用于橄榄油掺伪鉴别的实际与理论ECN42甘三酯含量绝对差值（△ECN42）测定方法。结果表明：采用示差折光检测器，柱温38℃，流动相为丙酮/乙腈（50∶50，V/V），流速：1.5 mL/min时，色谱分离效果好，ECN42甘三酯含量重复性好，RSD小于1%，再现性SR良好（0.02～0.11），为我国制定相应国家标准方法提供了依据。

关键词：橄榄油；掺伪；甘三酯；等效碳数42；△等效碳数42

橄榄油是以油橄榄鲜果为原料制取的油脂，在地中海沿岸国家有着几千年的历史，近年来逐渐受到我国消费者认可。我国橄榄油市场初期存在较严重的掺杂使假现象［1］。随着国家标准GB 23347—2009《橄榄油、油橄榄果渣油》［2］的颁布实施，较大程度规范了橄榄油市场，维护了消费者的利益。产品标准中对橄榄油实际与理论ECN42甘三酯含量绝对差值（△ECN42）进行了规定，见表1。目前尚未有《动植物油脂实际与理论ECN42甘三酯含量差值的测定》国家标准出台，所使用的检测方法为国际橄榄理事会（IOC）的原文方法，这给广大基层检验人员检测带来一定困难。因此，在我国建立相应的检测方法，形成检测方法标准具有现实的意义。

表1　实际和理论ECN42甘三酯含量最大差值（GB/T 23347—2009）

本实验研究橄榄油特征指标—实际与理论ECN42甘三酯含量绝对差值（△ECN42）的测定方法［3］，为我国制定相应国家标准方法提供依据。

1　材料与方法

特级初榨橄榄油1号、特级初榨橄榄油2号、精炼橄榄油、混合橄榄油、橄榄果渣油：取自西班牙；大豆油、玉米油、葵花籽油：市售。

洗脱液，石油醚/乙醚87/13（V/V），其中石油醚、乙醚均为分析纯；异辛烷、丙酮、乙腈，均为色谱纯；硅胶，70～230目；0.45 μm尼龙过滤膜。

玻璃色谱柱（内径21 mm，长450 mm）；旋转蒸发仪：瑞士步琪有限公司；电子天平（精度0.001 g）：瑞士梅特勒—托利多公司；1100系列高效液相色谱仪（配示差折光检测器）：美国安捷伦公司；6 890 N气相色谱仪：美国安捷伦公司。

制备硅胶柱：将25 g硅胶加入到80 mL洗脱液中制成悬浮液，倒入玻璃色谱柱中，通过敲打使硅胶沉降均匀，放出多余溶剂，溶剂液面略高于硅胶层。

油样洗脱：准确称取2.5±0.1 g油样于50 mL容量瓶中，用洗脱液定容至刻度。用移液管移取20 mL油样溶液，缓慢转移至硅胶柱中，用150 mL洗脱液进行色谱柱洗脱，流速约2 mL/min，整个洗脱时间约需60～70 min。用旋转蒸发器浓缩收集的馏出液，除去溶剂。所得试样用于高效液相色谱和气相色谱分析。

特级初榨橄榄油、中级初榨橄榄油、精炼橄榄油和混合橄榄油的样品回收率应至少90%，初榨油橄榄灯油和橄榄果渣油的样品回收率应至少80%。

准确称取0.5±0.001 g试样（1.3.1）于10 mL容量瓶中，用丙酮稀释定容至刻度，制备成5%样品溶液，经0.45 μm滤膜过滤用于液相分析。

液相分析条件：色谱柱：Merck Lichrospher© 100 RP-18（250 mm×4 mm，5 μm）；示差折光检测器；柱温38℃；流动相：丙酮/乙腈（50∶50，V/V）；流速：1.5 mL/min；进样量：10 μL；洗脱时间：60 min。

依据GB/T 17376—2008《动植物油脂脂肪酸甲酯制备》［4］进行甲酯化，依据GB/T 17377—2008《动植物油脂脂肪酸甲酯的气相色谱分析》进行脂肪酸组成分析。

气相分析条件：VF-23毛细管色谱柱（30 m 0.25 mm×0.25 μm），FID检测器；柱温：初始温度110℃，持续3 min，以4℃/min程序升温至220℃，保持20 min；检测器温度：260℃；进样口温度：260℃；载气为氮气，进样量1 μL。

等效碳数（ECN）定义为ECN=CN-2n，其中CN为脂肪酸碳数，n为脂肪酸双键数。例：油酸的ECN=18-2×1=16。常见C16和C18脂肪酸的等效碳数（ECN）见表2。甘三酯分子ECN则为所包含脂肪酸ECN的总和。例：甘三酯分子结构为OLLn，则其ECN=16+14+12=42。

表2　常见C16和C18脂肪酸的等效碳数（ECN）

根据Vander Wal提出的1，3-随机，2-随机学说［5］，由脂肪酸组成计算油样中ECN42甘三酯含量的理论值。橄榄油主要脂肪酸为C16和C18脂肪酸，因此在计算ECN42甘三酯含量的理论值时，只考虑C16和C18脂肪酸。具体橄榄油中ECN42理论值按下面步骤进行计算。

式中：n表示脂肪酸物质的量；A%表示脂肪酸的面积百分比；MW表示脂肪酸的分子量；下标分别代表不同的脂肪酸。

上述结果为每种脂肪酸占甘三酯（1，2，3-）位总的摩尔百分含量。

按下列公式计算不饱和脂肪酸（UFA）Po、O、L和Ln的摩尔百分含量总和及饱和脂肪酸（SFA）P和S的摩尔百分含量总和：

脂肪酸在甘三酯Sn-1和Sn-3位上分布相同；在Sn-2位上，饱和脂肪酸（P和S）和不饱和脂肪酸（Po，O，L和Ln）分布系数不同。

（2）不饱和脂肪酸［Po（2）、O（2）、L（2）和Ln（2）］在Sn-2位摩尔百分含量

（3）脂肪酸［P（1，3）、S（1，3）、Po（1，3）、O（1，3）、L（1，3）和Ln（1，3）］在Sn-1，3位摩尔百分含量：

依据公式7，8和9进行计算的9部分ECN42甘三酯含量加和，即为橄榄油中甘三酯ECN42含量的理论值。

2　结果与分析

实验中采用丙酮和乙腈作为流动相，考察不同比例丙酮/乙腈（40∶60、50∶50、55∶45）对油样甘三酯分离和峰形的影响。从图1中可以看出，随着丙酮比例增加，分析时间变短，分离度变差，峰形变尖锐。因此，综合考虑流动相比例最终选择50∶50（V/ V），这样既能保证满足所需要的分离度，同时又缩短分析时间，峰形较好。（图1中1、2、3中不同配比流动相下甘三酯的分离时间分别为70、52、38 min）

图1　不同比例丙酮/乙腈对甘三酯分离的影响

以50∶50（V/V）丙酮/乙腈混合物为流动相，实验中考察不同流速（1.2、1.5和1.8 mL/min）对特级初榨橄榄油甘三酯分离的影响。从图2可以看出不同流速条件下，分离度和峰形均较好，并且随着流速增加，分析时间缩短。考虑到1.8 mL/min对系统造成压力较大，长期使用会对液相色谱仪和色谱柱产生不利影响，因此最终流动相流速设为1.5 mL/ min。（图2中1、2、3中不同流速下甘三酯的分离时间分别为55、52、42 min）

图2　不同流速对甘三酯分离的影响

在丙酮/乙腈（50∶50）混合物为流动相，流速为1.5 mL/min条件下，比较35、38［6］和42℃不同的柱温对甘三酯组成的分离效果，见图3。结果表明：随着温度升高，分离时间相应缩短，但分离度变差。因此，综合考虑选择色谱柱温度为38℃。（图3中1、

图3　不同柱温对甘三酯分离的影响

橄榄油中除甘三酯外，还含有游离脂肪酸、甘一酯、甘二酯、角鲨烯、多酚等微量成分。这些物质有可能会引起ECN42含量增加，最终引起假阳性结果。从图4中可以看到，未经洗脱的样品，ECN42组分之前有一杂峰，影响ECN42组分的定量。

图4　样品处理前后的两个色谱图对比

1.处理前的ECN42液相色谱图 2.处理后的ECN42液相色谱图

以精炼橄榄油为例，表3中列出了精炼橄榄油未经洗脱时和洗脱后时的实际ECN42含量和△ECN42数值，可以看出由于未洗脱样品中ECN42前的杂峰影响，导致未洗脱样品的ECN42数值比洗脱后样品的ECN42数值略大，此时计算得到的△ECN42超过GB 23347—2009《橄榄油、油橄榄果渣油》中精炼橄榄油规定的△ECN42值（0.3），容易误判为油橄榄果渣油。因此，为了避免假阳性结果出现，在测定实际ECN42含量时样品需经色谱柱洗脱，进行纯化。

表3　洗脱前后精炼橄榄油的实际ECN42含量和△ECN42结果数值比较

在液相色谱条件下，甘三酯的流出顺序由甘三酯分子等效碳数（ECN）决定。相同ECN甘三酯保留时间接近，不同ECN甘三酯保留时间差距较大，随甘三酯ECN增加，保留时间延长。实际样品甘三酯色谱峰的定性是通过与豆油/纯橄榄油（30/70）混合物色谱图对照进行定性分析。图5中分别标出ECN42、ECN44、ECN46、ECN48、ECN50和ECN52组分。橄榄油中ECN42组分通常为三个峰，主要包含LLL+PoLL、OLLn+PoOLn、PLLn，见图6。

实验中采用面积归一化法进行定量。假定ECN42到ECN52的所有甘三酯峰面积总和为100%。按下列公式计算ECN42甘三酯的相对百分含量（XECN42）：

式中：AECN42─ECN42甘三酯的峰面积；ΣA─ECN42到ECN52所有甘三酯峰面积的总和。

图5　豆油/纯橄榄油（30/70）混合物甘三酯组成液相色谱图

图6　特级初榨橄榄油甘三酯组成液相色谱图

以特级初榨橄榄油2#为例，计算实际与理论ECN42甘三酯含量绝对差值（△ECN42）。

样品首先依据1.3.1进行前处理，然后依据1.3.2测定特级初榨橄榄油2#的实际ECN42甘三酯含量，ECN42实际为0.231。再依据1.3.3测定特级初榨橄榄油的脂肪酸组成，数据见表4。将表4数据按照1.3.4计算得ECN42理论为0.226。△ECN42 =︱0.231-0.226︱=0.005。

表4　特级初榨橄榄油2#的脂肪酸组成

实验中分别对2个样品（特级初榨橄榄油、掺30%葵花籽油的特级初榨橄榄油）进行△ECN42测定。每个样品取5份，分别通过柱色谱洗脱，收集洗脱馏分进行气相色谱分析和液相色谱分析。求得5次结果的相对标准偏差RSD，结果见表5。

从表5可以看出，△ECN42较低时，RSD偏大（68.0%），△ECN42较高时，重复性良好（0.693%）。分析原因，特级初榨橄榄油ECN42甘三酯含量低，使用的液相示差检测器易受环境温度影响，因此造成△ECN42较低时，RSD偏大，但在IOC方法允许范围内。

表5　△ECN42测定重复性研究

实验中选取4个△ECN42含量不同水平油脂样品，邀请了5家实验室，测定实际与理论ECN42甘三酯含量差值（△ECN42），每家实验室每个样品重复测定5次。通过数理统计，剔除异常值后，计算不同水平样品△ECN42含量的再现性标准偏差，结果见表6。△ECN42含量总体再现性良好。

表6　各样品△ECN42的m，sR值

实验中，对特级初榨橄榄油1号和2号、精炼橄榄油、特级初榨橄榄油掺5%大豆油、特级初榨橄榄油掺5%葵花籽油、精炼橄榄油掺5%大豆油、精炼橄榄油掺5%葵花籽油共7个实际样品，进行实际与理论ECN42甘三酯含量绝对差值（△ECN42）的测定。以上7个样品的△ECN42计算结果见表7。从表7可以看出，特级初榨橄榄油1号和2号、精炼橄榄油3个样品的△ECN42均小于GB 23347—2009《橄榄油、油橄榄果渣油》相应规定。而不同等级的橄榄油：特级初榨橄榄油和精炼橄榄油，加入5%高亚油酸的籽油后△ECN42远大于标准中规定的最大差值0.2、0.3。因此，测定△ECN42是一个很好鉴别橄榄油中是否掺有籽油的方法。

表7　不同样品的△ECN42值

3　结论

本实验建立了一种基于气相色谱和液相色谱技术的橄榄油实际与理论ECN42甘三酯含量绝对差值（△ECN42）的测定方法，该方法的重复性和再现性良好，能够满足实际橄榄油样品△ECN42的测定，为我国制定相应国家标准方法提供了依据。同时，该方法可应用于橄榄油是否掺有籽油的鉴别，具有现实意义。

［1］张欣，于瑞祥，方晓明，等.橄榄油掺假检测技术的研究进展［J］.中国油脂，2013，38（3）：67-71.

［3］IOOC，COI/T.20/Doc.No 20/Rev.3 2010，Determination of The Different Between Actual and Theoretical Content of Triacyglycerols with ECN42［S］.

［5］丁冬有，毕艳兰，杨国龙.计算机技术在甘三酯组分含量计算中的应用［J］.中国粮油学报，2007，22（4）：133-136.

［6］Christopoulou E，Lazaraki M，Komaitis M，Kaselimis K.Effectiveness of determinations of FAtty acids and triglycerides for the detection of adulteration of olive oils with vegetable oils［J］.Food Chemistry， 2004，84：463-474.

Research on determination of the difference between actual and theoretical content of triacylglycerols with ECN42 in olive oil

Abstract：The method of calculating theoretical content of triacylglycerols with ECN42 in olive oil was introduced，which distinguished adulteration of olive oil by determination of the absolute difference between actual and theoretical content of triacylglycerols with ECN42（△ECN42）.The HPLC condition to quantify ECN42，and the reproducibility of the method was researched.The results showed that using differential refractometer as the detector，column temperature 38℃，mobile phase acetone/acetonitrile（50∶50，V/V），flow rate 1.5 mL/min，under the condition，it showed a good chromatographic separation effect with good repeatability，and RSD less than 1%and SRbetween 0.02 and 0.11.It provided basis for instituting national standard.

橄榄油实际与理论ECN42甘三酯含量绝对差值测定方法研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论

1　材料与方法

2　结果与分析

3　结论