图1 镰刀菌大型分生孢子形态图
欧阳毅，唐 芳，张海洋，祁智慧，程树峰
（国家粮食局科学研究院，北京 100037）
摘 要：基于脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）产毒菌镰刀菌形态特征，以其大型分生孢子为检测目标物，初步建立一种新的小麦DON筛查方法。样品直接用水振荡提取，100目滤布过滤，滤液于显微镜下镜检。检测时间约3 min。对不同感染水平的小麦阳性样品进行镰刀菌大孢子检验（n=6），方法相对标准偏差（RSD）为7.1%～21.6%。对我国小麦主产区的72个小麦样品进行检验，用HPLC法作对照。结果表明，样品中有46个未检出镰刀菌大孢子，占样品总数的63.9%，这些样品DON含量为0～792.4 μg/kg，均未超过国家限量标准1 000 μg/kg；有26个样品检出大孢子，DON未超标为6个，但均有检出，其余大部分样品镰刀菌生长量与其产生DON的产量呈正相关。由此可见，通过本方法，可快速的对批量小麦DON超标与未超标样品进行筛查区分。
关键词：小麦DON；筛查；镰刀菌大孢子
小麦脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）是由多种镰刀菌产生的一种单端孢霉烯族类化合物，其中以禾谷镰刀菌占绝对优势，据国内17省市采样分析，该种占93%，其次为燕麦镰刀菌［1］。在我国小麦DON污染十分普遍，主要发生于长江中下游的江苏、浙江、安徽、湖北及东北垦区，近年来，污染区域逐年扩大，已波及黄淮海和西北等广大冬麦区。由于小麦DON污染涉及面广、危害性大，已引起国家相关管理部门的高度关注。我国现行的小麦和小麦粉中DON国家限量标准规定，DON含量不得超过1 000 μg/kg［2］。这对于保障我国粮食安全是十分必要的。
小麦DON检验在我国是一项经常性的工作。它的特点是样品量大，检测时间长，费用高，并需要大型分析仪器。采用一种简单、快速、经济的筛查方法，将大量未超标小麦样品
从被检样品中分离，不仅可大大提高工作效率，也可解决我国小麦DON分析成本过高的问题。目前，国内外对真菌毒素快速检测方法研究甚多，主要集中在酶联免疫法（ELISA）［3］、免疫胶体金技术［4］、基因芯片［5］以及液相芯片［6］等，有些方法技术上趋于成熟，但仪器设备昂贵、检测成本高等限制，用于大量样品的快速筛查仍存在较大困难。近十几年，我国在镰刀菌产生DON毒素规律上也进行了大量研究，王裕中［7］等从我国苏、浙、皖、闽、川、豫、冀、陕、黑等11个省市收集赤霉病穗分离获得的40多种禾谷镰刀菌，通过不同菌株产毒能力的测定，结果表明，所有禾谷镰刀菌均有产毒能力。谢茂昌［8］等研究表明，小麦赤霉病发病程度与DON产量之间存在极显著相关性。Miller等研究表明［9］，镰刀菌产生DON的产量与镰刀菌生长量呈正相关。前人大量研究表明，小麦DON污染程度与镰刀菌生长密切相关。本实验基于产毒镰刀菌生长形态特征，尝试以镰刀菌大孢子为检测目标物，建立一种小麦DON污染快速筛查的新方法，为小麦收购过程中现场快速筛查方法的研究提供一个新思路。
1.1 样品
小麦：来自于黄淮小麦主产区。
1.2 试剂和仪器
SMART双目生物显微镜：重庆奥特公司；PL403 -IC电子天平：上海Mettler-Toledo公司；血球计数板：上海求精生化试剂仪器公司；LC-10AT高效液相色谱仪：日本SHIMADZU公司。实验用水为Millipore制备的超纯水。
1.3 方法
1.3.1 样品前处理
取10.0 g小麦样品，于80 mL试管中，加入30 mL水，加塞，剧烈振荡1.5 min，用100目滤布过滤，收集滤液备用。
1.3.2 孢子计数
用滴管取少量上述收集液，采用虹吸方法将提取液加入血球计数板中，在160×显微镜下进行孢子计数。
1.3.3 HPLC小麦DON检测方法［10］
小麦DON检测方法按文献［10］进行测定。
2.1 镰刀菌孢子特征
自然条件下小麦等作物感染镰刀菌，初期多附着在粮粒表面生长，按方法1.3.1对样品进行处理，可将粮粒表面感染的镰刀菌孢子清洗到提取液中。镰刀菌生长大多为无性繁殖，主要是在菌丝上长出分生孢子，这些孢子形状各异，主要分为小型分生孢子和大型分生孢子。小孢子形状多，体积小，不易辨认。而大分生孢子体积大，形状较为单一，多呈镰刀形，有3～10隔，特征明显易显微镜下观察辨认，如图1（A-B）所示。因此，可对提取液中大孢子进行计数，进而反映DON污染情况。
图1 镰刀菌大型分生孢子形态图
2.2 计数方法说明
自然污染小麦样品按方法1.3.1提取后，按方法1.3.2对提取液中大孢子镜检计数。由于大孢子一般较长（十几微米到几十微米），远大于细菌和酵母，仅对标准血球计数板计数区中的孢子进行计数，会给计数结果带来较大的误差，因此，在原有计数方法的基础上加以改进，对整个计数平台中的镰刀菌大孢子进行计数，计数体积约为6 mM3如图2所示。
图2 镰刀菌孢子计数平台
2.3 样品提取条件优化
分别称取10、15、20 g被感染的小麦样品，按照1.3.1步骤，进行小麦样品前处理，显微镜下镰刀菌大孢子计数，每个样品三次重复，取平均值，结果如图3所示，随着样品重量的增加，镰刀菌孢子计数结果也梯度增长，不同称样量对样品镰刀菌孢子计数的结果无明显影响，本实验中样品称样量定为10 g。
图3 样品称样量优化
同样操作步骤，提取时间分别为1.0、1.5、2.0、3.0 min，并对提取液进行显微镜计数，结果如图4所示，提取时间为1.0 min时镰刀菌孢子提取不充分，提取时间在1.5 min以上时对小麦样品中镰刀菌孢子计数结果无明显的影响，镰刀菌孢子浓度均为4.0×105个/g，因此本方法将提取时间定为1.5 min。
图4 样品提取时间优化
图5 滤布孔径优化
选择80、100、200、300、400目孔径的滤布对过滤条件进行优化，其他操作步骤按照1.3.1步骤，结果如图5所示，80、100目孔径滤布对镰刀菌孢子计数结果无明显影响，镰刀菌孢子浓度在2.9×105～ 3.0×105个/g之间，200、300、400目滤布随孔径变小，镰刀菌孢子数逐渐减少。由于孔径大的滤布，提取液过滤时，通过滤布的杂质也较多，对镜检计数视野有影响，因此本方法选择孔径100目滤布。
2.4 精密度
选择三个水平感染的小麦样品，按方法1.3.1对样品进行处理，并进行镰刀菌大孢子计数，结果见表1。
表1 方法精密度试验结果（n=6）
由表1可知，三个感染梯度小麦样品，六次重复，相对标准偏差（RSD）为7.1%～21.6%。这一结果对于微生物常规检验，误差处于一个较低的水平。由此可看出，本方法具有较好的重复性。
2.5 样品测定结果对比
按方法1.3.1和1.3.2，对从我国黄淮小麦主产区收集72份样品进行处理，并对镰刀菌大孢子计数，同时按1.3.3对每个样品进行色谱定量检测，检测结果见表2。
表2 镰刀菌大孢子计数结果与HPLC检测结果对比
续表
将镰刀菌计数大孢子计数结果与HPLC定量检测结果进行比较。72个小麦样品中，46个样品未检出镰刀菌大孢子，占小麦样品的63.9%，这46个样品中，有32个样品DON未检出，14个样品DON检出范围在384.8～792.4 μg/kg，均值在602.3 μg/ kg，远低于国家限量标准1 000 μg/kg。分析原因，显微镜计数法是通过剧烈振荡提取得到镰刀菌大孢子悬浮液，计数结果为未检出，并不代表镰刀菌完全不生长，只是生长量少，孢子浓度在显微计数法检出限以下，产生的DON毒素也相应要低得多，从现有数据来看，远低于国家限量标准，初步可以确定，镰刀菌大孢子未检出的情况下DON毒素含量不超标。显微镜镜检计数法的检出限量值还需进一步检测不同地区的大量样品加以确认。
镰刀菌大孢子检出样品共有26个，其中6个样品虽有检出，但DON含量不超标，占阳性样品的23.1%，应属毒素产量较低的镰刀菌种。其余20个样品均已超过国家限量标准，在这20个样品中，有3个样品大孢子检出量非常高，但毒素含量没有明显升高，也应属毒素产量低的镰刀菌种。其余17个样品污染的镰刀菌产毒水平大致相同，对大孢子检出量与DON含量进行相关性分析，得到线性回归方法为Y=43.327 X+1 739.9，相关系数R可达0.882（图6），进一步验证了镰刀菌产生DON的量与镰刀菌生长量呈正相关的结论。
图6 镰刀菌大孢子检出量与DON含量回归曲线
对小麦样品中镰刀菌孢子的提取条件进行了优化，最佳样品提取条件为：样品称取量10 g，提取时间1.5 min，滤布孔径100目。对小麦样品进行了重复性实验（n=6），相对标准偏差（RSD%）范围在7.1%～21.6%，对微生物常规检测方法而言，本方法具有良好的重复性。
在小麦主产区72个样品（来自16个地区的样品）的基础上，对镰刀菌大孢子的数量与DON毒素含量的关系进行分析，结果表明，样品中有46个未检出镰刀菌大孢子，占样品总数的63.9%，这些样品DON含量为384.8～792.4 μg/kg，均未超过国家限量标准1000 μg/kg；有26个样品检出大孢子，DON未超标为6个，但镰刀菌大孢子均有检出，且镰刀菌生长量与其产生DON的产量呈正相关。因此，可初步确认显微镜下大孢子未检出时，DON毒素低于国家限量标准，本方法可快速的对批量小麦DON超标与未超标样品进行筛查区分。
所需检测仪器（国产显微镜即可满足检测要求）价格低、携带方便，操作成本低，单个样品低于1元钱，操作简单快速，单个样品检测时间3 min左右，可满足粮食收购中现场快速筛查的需要，为小麦DON毒素的快速筛查方法提供了一个新的研究思路。
参考文献：
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［10］GB/T 23503—2009，食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定免疫亲和柱层析净化高效液相色谱法［S］.
Research on rapid screening method for deoxynivalenol（DON）in wheat
OUYANG-yi，TANG FAng，ZHANG Hai-yang，QI Zhi-hui，CHENG Shu-feng
（Academy of State Administration of Grain，Beijing 100037）
Abstract：A new deoxynivalenol（DON）detection method which based on the morphological characteristic of fusarium that produces DON in wheat was preliminary set up.Fusarium conidiophores were the detected target of this method.The spores in the samples were oscillated in water，filtered with 100 mesh filter cloth and the spores in the filtrate were microscopic tested using a microscope.The whole process takes three minutes.The relative standard deviation（RSD）of the wheat positive samples test（n=6）with different infection levels was 7.1%～21.6%.72 wheat samples collected from main wheat producing areas in China were inspected by this method，and the HPLC method was used as the control.The results showed that fusarium conidiophores were nearly not found in 46 samples，account for 63.9%of the total samples，in which DON concentration range were 0～792.4 μg/kg which did not exceed the limitation of national standard 1 000 μg/kg.The fusarium conidiophores were detected in 26 samples，in which DON were not exceed the limitation in 6 samples，and the growth of fusarium was positively related to the yield of DON.The small batch of wheat can be quickly screened out by this method whether exceeding the DON limitation standard.
Key words：DON in wheat；screen； megaspore of fusarium
中图分类号：TS 211.7
文献标识码：A
文章编号：1007-7561（2016）05-0073-04
收稿日期：2016-03-18
作者简介：欧阳毅，1987年，女，助理研究员.
通讯作者：唐芳，1978年，女，副研究员.