表1 五味子乙醇提取物MIC测定 mm
张媛媛，冯亚净，李书国
(河北科技大学 食品科学与工程系，河北 石家庄 050018)
摘 要：研究五味子乙醇提取物的抑菌稳定性、抑菌机理及在馒头贮藏保鲜中的应用。通过牛津杯法和二倍稀释法测得五味子乙醇提取物的最低抑菌浓度(MIC)在1.75～7 mg/mL之间。探索了pH值、超声处理、贮藏时间以及食品体系中的葡萄糖、NaCl、金属离子等对五味子乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、毛霉和曲霉的抑菌效果稳定性的影响。结果表明，五味子乙醇提取物抑菌稳定性受超声波影响不大，适合酸性食品的保鲜；抑菌活性随贮藏时间的延长逐渐减弱；葡萄糖有增加抑菌效果的作用；添加Fe3+、K+、Ca2+、Mg2+等金属离子的提取液对大肠杆菌和曲霉的抑制作用均有所增加，但除Fe3+外，添加其他三种金属离子的提取液对金黄色葡萄球菌的抑制作用有所减弱，对毛霉的抑制作用影响不明显；不同浓度的NaCl对五味子乙醇提取物抑菌作用的影响不同，且对不同菌种的影响也不同。电导率法得出五味子乙醇提取物的抑菌机制可能是其破坏了微生物细胞的膜结构，失去对微生物细胞的保护作用，从而达到抑菌目的。
关键词：五味子；抑菌效果；稳定性；抑菌机理
五味子(Shisandra ehinensis(Turez.)Bail)，因其果实具有甘、酸、辛、苦、咸五味而得名，又名五梅子、玄及、山花椒等，为木兰科(Magnoliaceae)五味子属植物，是我国重要的药食两用资源。《中华人民共和国药典》中规定其种子、果实、藤茎均可入药[1]，具有益气生津、收敛固涩、补气宁心等功效[2]，是产自东北三省的名贵中药材。木脂素类成分是五味子的主要药用成分[3]，其活性成分以五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素等为代表。目前国内外对五味子的研究主要集中在种类差异、成分分析、药理作用等方面[4]，而对五味子抑菌作用的报道较少。前期研究发现，五味子乙醇提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等细菌以及霉菌有显著的抑制作用[5]。本文旨在探讨五味子提取物的抑菌稳定性，为将五味子开发成新型安全天然食品防腐剂提供依据。
1.1 试剂与材料
牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉(生物试剂)：北京奥博星生物技术有限公司；葡萄糖、氢氧化钠、蔗糖、氯化钠、无水乙醇，均为分析纯；北五味子(Fructus Schisandrae Chinensis，五味子的一种)：石家庄市新兴药房。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、毛霉(Mucormucedo)、曲霉(Aspergillus)：由河北科技大学微生物学实验室提供。
1.2 主要仪器
LHS-150恒温恒湿箱；SZF-06A型快速提取仪；UV-2000型紫外可见分光光度计；YMSII-280B型手提式压力蒸汽灭菌锅；GZX-9070型电热鼓风干燥箱；YPW-I型回转式恒温调速摇瓶柜；KQ-2200型超声波清洗器；AP-2型电导率仪。
1.3 实验方法
1.3.1 五味子乙醇提取物的制备
五味子经60 ℃干燥2 h后，粉碎，超声15 min，以85%的乙醇为提取溶剂，在85 ℃温度、1∶10的料液比的条件下回流提取2次，合并提取液，得五味子乙醇提取物，浓度为28 mg/mL，冷却后备用。
1.3.2 五味子乙醇提取物抑菌效果的测定
将各实验菌种活化后，用无菌生理盐水稀释，调整菌悬液浓度在107～108 CFU/mL，备用。将适量已灭菌的培养基缓慢注入培养皿中，待凝固后，平板涂布菌悬液100 μL，平稳放入牛津杯。平行组各取100 μL五味子乙醇提取物缓慢加入牛津杯中，对照组为经过相应处理后的85%乙醇，实验重复3次。将各平板置于恒温恒湿培养箱中培养，细菌培养24 h(温度37 ℃，湿度80%)，霉菌培养48 h(温度28 ℃，湿度80%)，用十字交叉法测量其抑菌圈直径[6]。
1.3.3 五味子乙醇提取物最低抑菌浓度测定
采用倍比稀释法用85%的乙醇将28 mg/mL的五味子乙醇提取物配制成1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32和1∶64七个系列梯度各5 mL，使质量浓度分别为28、14、7、3.5、1.75、0.875、0.438 mg/mL。采用牛津杯法，通过测量抑菌圈直径，以提取物对受试菌有抑菌圈的最小浓度为最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)。
1.3.4 五味子乙醇提取物抑菌作用稳定性研究
食品防腐剂在应用的过程可能会受到外界条件和食品中某些成分的干扰，食品的酸碱度等对防腐剂的稳定性有一定的要求，食品咸味剂如钾盐、钠盐，食品原料如葡萄糖等重要成分也会对防腐剂有特殊的要求。生活中常见的食品如豆腐所用的卤水主要成分有氯化镁、硫酸钙、氯化钙等含金属离子的物质，肝类食物含有丰富的铁元素，诸如此类的特殊成分都会对防腐剂有不同的稳定性要求。针对模拟食品体系的主要因素对五味子乙醇提取物的抑菌抗菌活性的影响进行探讨。
1.3.4.1 pH值对五味子乙醇提取物抑菌效果的影响
用HCl和NaOH溶液调节五味子乙醇提取物的pH值分别为3、5、7、9，以相应pH水溶液为对照，以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、毛霉和曲霉为供试菌种，测定其抑菌效果。
1.3.4.2 超声波对五味子乙醇提取物抑菌效果的影响
采用功率为100 W，频率为40 kHz的超声波，分别处理五味子乙醇提取物0、10、20、30、40、60 min，以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、毛霉和曲霉为供试菌种，测定其抑菌效果。
1.3.4.3 保存时间对五味子乙醇提取物抑菌效果的影响
将新提取的五味子乙醇提取物放在25 ℃的条件下保存，每隔3 d以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、毛霉和曲霉为供试菌种，测定其抑菌效果。
1.3.4.4 葡萄糖、NaCl对五味子乙醇提取物抑菌效果的影响
在五味子乙醇提取物中加入葡萄糖或NaCl，调节葡萄糖或NaCl的浓度分别为0、0.005、0.01、0.015 mol/L，以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、毛霉和曲霉为供试菌种，测定其抑菌效果。
1.3.4.5 金属离子对五味子乙醇提取物抑菌效果的影响
在五味子乙醇提取物中分别加入NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4和FeCl3，配成含0.05 mol/L的Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Fe3+的混合液，混合静置3 h，以原液作为对照，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、毛霉和曲霉为供试菌种，测定其抑菌效果[7]。
1.3.5 五味子乙醇提取物抑菌机理初探
电导率是衡量溶液中离子强度高低的一个特征参数，其值与离子组分浓度密切相关，电导率的测定具有灵敏、快速、准确、简便的特性。菌体的保护屏障是细胞膜，当遇到强抑菌剂时会使细胞膜遭到破坏，此时打破了菌体的保护屏障，其内部的电解质会外泄至溶液中，进而使电导率上升，因此菌液电导率的变化反映了细胞膜通透性的变化[8]。
用无菌水调节菌液浓度为107 CFU/mL，移取1.5 mL菌液于50 mL烧杯中，加入30 mL去离子水和1.5 mL五味子乙醇提取物，然后分别在0、5、20、30、60、90、120、150和180 min时测定电导率，每次实验重复三次。以添加1.5 mL浓度为85%的乙醇为空白对照。
1.3.6 五味子乙醇提取物在馒头保鲜中的应用
将化学防腐剂脱氢乙酸钠、丙酸钙配制成与五味子乙醇提取物相同浓度的溶液，即28 mg/mL，采用涂抹的方式，分别将五味子乙醇提取物、脱氢乙酸钠溶液和丙酸钙溶液涂抹在紫面馒头表面，设置空白对照，在温度为37 ℃、湿度为80%的恒温恒湿培养箱中保存，观察馒头的品质变化情况。
2.1 五味子乙醇提取物MIC的测定
大量数据显示，75%的乙醇有很强的抑菌作用，浓度升高会影响抑菌效果，主要因为升高浓度会使细菌细胞壁的通透性降低，抑菌活性减弱。在前期研究中发现，85%的乙醇对受试菌的抑制作用非常弱。因此，选用85%的乙醇作为溶剂，对五味子提取液的抑菌活性影响认为可以忽略。由表1可知，五味子乙醇提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌两种细菌的最低抑菌浓度MIC<1∶4，即质量浓度<7 mg/mL，对毛霉的最低抑菌浓度MIC<1∶8，即质量浓度<3.5 mg/mL，对曲霉的最低抑菌浓度MIC<1∶16，即质量浓度<1.75 mg/mL。五味子乙醇提取物对四种受试菌有良好的抑制作用。
表1 五味子乙醇提取物MIC测定 mm
注：通过测量抑菌圈直径测定MIC；-代表无抑菌圈。
2.2 五味子乙醇提取物抑菌作用稳定性研究
2.2.1 pH值对五味子提取物抑菌效果的影响
由图1可知，pH值的变化对五味子提取物的抑菌效果影响较大。在pH=3时，抑菌效果显著，随着pH值的增加，抑菌效果明显减弱，当接近中性时，抑菌效果有一定的增强趋势，碱性条件下抑菌效果较弱。可见，在酸性范围内五味子乙醇提取液的抑菌效果较强，可能是由于改变介质pH值后，抑菌成分的电离度或者与H+的结合程度随之改变，也有可能抑菌物质能够与碱发生反应而被破坏，抑或形成盐后失去抑菌活性，从而使提取液的抑菌效果减弱。根据实验结果，五味子乙醇提取物适用于pH<5的食品保鲜。
图1 pH值对提取物抑菌效果的影响
2.2.2 超声波处理对五味子乙醇提取物抑菌效果的影响
图2 超声时间对提取物抑菌效果的影响
超声波由于高频的特性而被广泛应用于植物有效成分的提取，其原理是将植物原料的细胞震碎，加速有效成分的扩散并溶于提取溶剂，但是长时间的超声处理是否会对有效成分的结构造成破坏或分解还有待研究。如图2所示，经超声波处理后，五味子乙醇提取物对不同的受试菌抑菌效果是不同的。对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和曲霉的抑制作用基本变化不大，且在处理60 min后抑菌圈直径仍分别有25、19和26 mm。超声时间在10 min以内，随着超声时间的延长，提取液对毛霉的抑制作用逐渐减弱，随后作用基本稳定，可能是由于超声波的作用破坏了抑制毛霉生长的物质成分，在10 min以后成分不再变化，抑制作用趋于稳定。总的来说，五味子提取物抑菌效果在超声波处理下具有较好的稳定性。2.2.3 保存时间对五味子乙醇提取物抑菌效果的影响
由图3可知，放置一定的时间后，五味子乙醇提取物对不同受试菌的抑制作用差异较大。在常温下放置3 d，提取液对金黄色葡萄球菌和毛霉的抑制作用没有变化，而对大肠杆菌的抑制作用逐渐减弱，对曲霉的抑制作用有所增加；在保存3～12 d的阶段内，提取液对金黄色葡萄球菌、毛霉和曲霉的抑制作用有所减弱，抑菌圈直径分别达到24、20和23 mm，而对大肠杆菌的抑制作用有增强的趋势；在保存12 d以后，五味子乙醇提取物对四种受试菌的抑制作用均显著减弱，说明随着放置时间的延长，五味子抑菌成分的含量在光照、氧气等的作用下会有所减少，从而使提取液的抑菌活性降低。因此，五味子乙醇提取物不宜保存过长时间，可考虑将液体提取物经减压浓缩和冷冻干燥制成粉末保存。
图3 保存时间对提取物抑菌效果的影响
2.2.4 葡萄糖、NaCl对五味子乙醇提取物抑菌效果的影响
葡萄糖、NaCl对五味子乙醇提取物抑菌效果的影响的实验结果见图4～图5。由图4可以看出，随着葡萄糖浓度的增大，五味子乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、毛霉和曲霉的抑菌效果逐渐增强，其中，对金黄色葡萄球菌和曲霉的抑菌圈直径最高达30 mm。结果表明，葡萄糖对提取液的抑菌作用有一定的影响，并且在一定程度上有增效的作用，可能是由于糖本身具有一定的抑菌活性。
图4 葡萄糖对提取物抑菌效果的影响
由图5可知，加入NaCl对五味子乙醇提取物的抑菌作用有一定的影响。随着NaCl浓度的增加，提取液对金黄色葡萄球菌和毛霉的抑制作用基本呈下降的趋势，在NaCl浓度为0.015 mol/L时抑菌圈直径达到最低，分别为23、15 mm；而对于曲霉，随着NaCl浓度的增加，抑菌作用逐渐增强，抑菌圈直径最高达29 mm；在NaCl浓度低于0.005 mol/L时，提取液对大肠杆菌的抑制作用随NaCl浓度的升高逐渐下降，超过这个浓度后抑制作用明显增强。结果表明，不同浓度的NaCl对五味子乙醇提取物抑菌作用的影响不同，且对不同菌种的影响也不同，在实际应用过程中应该充分考虑食品中NaCl的含量。
图5 NaCl对提取物抑菌效果的影响
2.2.5 金属离子对五味子乙醇提取物抑菌效果的影响
由图6可知，0.05 mol/L的金属离子能够在一定程度上影响五味子乙醇提取物的抑菌活性，但不同金属离子对不同受试菌的影响有差异。在K+、Ca2+、Mg2+的作用下，五味子乙醇提取物对大肠杆菌和曲霉的抑制作用均有所增加，但对金黄色葡萄球菌的抑制作用有所减弱，对毛霉的抑制作用影响不明显；在Fe3+作用下，提取液的抑菌活性明显提高，尤其对曲霉的抑制作用，曲霉的抑菌圈直径由原提取液的25 mm增高到36 mm，对其他的受试菌的抑制均有不同程度的增效作用；添加Na+的提取液除对曲霉的抑制有增效作用外，对金黄色葡萄球菌和毛霉的抑制作用均有所减弱。金属离子对五味子乙醇提取物的抑菌效果有所减弱的原因可能是其对抑菌成分有破坏作用，或能够与抑菌成分发生反应，降低抑菌作用，而能够增加抑菌效果的原因有可能是因为金属离子本身有抑菌活性，或发生反应后的物质对受试菌有更强的抑制作用，需要作进一步的研究和探讨。
图6 金属离子对提取物抑菌效果的影响
2.3 五味子乙醇提取物抑菌机理的初探
五味子乙醇提取物对四种受试菌菌液电导率的影响结果如图7～图10所示。
图7 金黄色葡萄球菌菌液电导率的变化
图8 大肠杆菌菌液电导率的变化
图9 毛霉菌液电导率的变化
图10 曲霉菌液电导率的变化
由上图7～图10可知，添加五味子乙醇提取物的菌液的电导率明显高于不添加提取物的空白组，原因可能是提取物中含有少量小分子物质和金属离子，或者抑菌成分破坏了菌体的细胞膜，细胞中快速渗透出小分子物质导致电导率上升[9]；添加提取液的实验组在5 min时的电导率有所升高，5 min以后电导率缓慢增加，整体上电导率呈上升的趋势，说明五味子乙醇提取液中的抗菌抑菌成分在5 min时开始发挥作用，破坏了细胞膜，使菌体细胞内的离子渗出，从而达到了抗菌的目的。
2.4 五味子乙醇提取物在馒头中的应用
如图所示，在高温高湿的条件下，第3 d时空白组馒头表面开始发霉，其他涂抹防腐剂的馒头没有明显的长霉情况；第5 d时，空白组、涂抹脱氢乙酸钠组和涂抹五味子乙醇提取物的馒头霉变明显，其中，空白组最为明显，其次为脱氢乙酸钠组，涂抹五味子乙醇提取物组更次之，而涂抹丙酸钙溶液的馒头刚开始出现霉变情况。结果表明五味子乙醇提取物对馒头的防腐保鲜有一定的作用，其抑菌效果略差于丙酸钙，但优于脱氢乙酸钠。
图11 高温高湿条件下馒头的品质变化
注：1，涂抹脱氢乙酸钠溶液；2，涂抹五味子乙醇提取物；3，涂抹丙酸钙溶液；4，空白对照。
五味子乙醇提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌两种细菌的最低抑菌浓度MIC<7 mg/mL，对毛霉的最低抑菌浓度为3.5 mg/mL，对曲霉的最低抑菌浓度为1.75 mg/mL。
pH值的变化对五味子乙醇提取物的抑菌效果影响较大，在pH=3时，抑菌效果显著，随着pH值的增加，抑菌效果明显减弱，当接近中性的条件下，抑菌效果有一定的增强趋势，碱性条件下抑菌效果较弱；超声波对提取液的抑菌效果影响不大，在处理60 min后五味子乙醇提取物对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和曲霉的抑菌圈直径仍分别有25、19和26 mm；随着在常温下放置时间的延长，提取液对四种受试菌的抑制作用基本表现逐渐减弱的趋势；葡萄糖对提取液的抑菌作用有一定的影响，在一定程度上有增效的作用，不同浓度的NaCl对五味子乙醇提取物抑菌作用的影响不同，且对不同菌种的影响也不同，在实际应用过程中应该充分考虑食品中NaCl的含量；添加Fe3+、K+、Ca2+、Mg2+的提取液对大肠杆菌和曲霉的抑制作用均有所增加，但除Fe3+外，添加其他三种金属离子的提取液对金黄色葡萄球菌的抑制作用有所减弱，对毛霉的抑制作用影响不明显，添加Na+的提取液对各受试菌的影响不大。
五味子乙醇提取物中具有抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、毛霉和曲霉的抗菌抑菌成分，抑菌机理可能是破坏了细胞的膜结构。五味子乙醇提取物在馒头的防腐保鲜中有一定的作用，可以作为天然的食品防腐剂使用。
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ZHANG Yuan-Yuan，FENG Ya-Jing，LI Shu-Guo
(HeBei University of Science and Technology，Shijiazhuang Hebei 050018)
Abstract：The antimicrobial stabilities，mechanism of ethanol extracts fromFructus Schisandrae Chinensis(FSC)and its application on storage of steamed bread were studied in this article.The antibacterial effect and the minimal inhibitory concentration(MIC)of ethanol extracts from FSC were determined by the oxford cup method and two-fold dilution method，the results showed that the MIC were between 1.75～7mg/mL.By changing the pH value，ultrasonic treatment，extend the preservation time and adding glucose，NaCl，metal ions，discussed the stability of ethanol extract from FSC against staphylococcus aureus，escherichia coli，mucormucedo and aspergillus.The results showed that the antibacterial effect of ethanol extracts had good stability of the ultrasonic，and was suitable for the application of acidic foods；with the extension of time under normal temperature，the inhibitory effect was gradually weakened；the inhibitory effect of ethanol extract from FSC had synergistic effect with glucose；the inhibitory effects against Eescherichia coli and aspergillus increased when added metal ions，but besides Fe3+，the inhibitory effect against staphylococcus aureus weakened and against mucormucedo was not obvious.The effects of different concentrations of NaCl on the antimicrobial activity were different.The antibacterial mechanism of ethanol extracts from FSC may be due to they destroyed the membrane structure of cells，providing a basis for the research of antibacterial mechanism.
Key words：Fructus Schisandrae Chinensis；Antibacterial effect；Stability；Antimicrobial mechanism
收稿日期：2015-06-26
基金项目：河北省大学生创新创业训练项目(201310082045)
作者简介：张媛媛，1989年出生，女，硕士研究生.
通讯作者：李书国，1969年出生，男，教授.
中图分类号：TS 202.3
文献标识码：A
文章编号：1007-7561(2016)01-0055-06